Hongcheng Wang, Bo Xu
Alkalmazási K+F Központ
Bevezetés
Az állófázis és a mozgófázis relatív polaritása szerint a folyadékkromatográfia normál fázisú kromatográfiára (NPC) és fordított fázisú kromatográfiára (RPC) osztható.Az RPC esetében a mobil fázis polaritása erősebb, mint az állófázié.Az RPC a folyadékkromatográfiás elválasztási módokban a legszélesebb körben használt módszerré vált nagy hatékonyságának, jó felbontásának és tiszta retenciós mechanizmusának köszönhetően.Ezért az RPC alkalmas különféle poláris vagy nem poláris vegyületek elválasztására és tisztítására, beleértve az alkaloidokat, szénhidrátokat, zsírsavakat, szteroidokat, nukleinsavakat, aminosavakat, peptideket, fehérjéket stb. Az RPC-ben a leggyakrabban használt állófázis a a szilikagél mátrix, amely különféle funkciós csoportokhoz kötődik, beleértve a C18, C8, C4, fenil, ciano, amino stb.Becslések szerint az RPC-k több mint 80%-a jelenleg C18 kötött fázist használ.Ezért a C18 kromatográfiás oszlop minden laboratórium kötelező univerzális oszlopává vált.
Bár a C18 oszlop nagyon sokféle alkalmazásban használható, néhány nagyon poláros vagy erősen hidrofil minta esetében azonban a szokásos C18 oszlopok problémákat okozhatnak az ilyen minták tisztítása során.Az RPC-ben az általánosan használt elúciós oldószerek polaritásuk szerint rendezhetők: víz < metanol < acetonitril < etanol < tetrahidrofurán < izopropanol.Ahhoz, hogy ezeknél a mintáknál (erősen poláris vagy erősen hidrofil) jó visszatartást biztosítsunk az oszlopon, nagy mennyiségű vizes rendszert kell használni mozgófázisként.Ha azonban a tisztavizes rendszert (beleértve a tiszta vizet vagy a tiszta sóoldatot is) használjuk mozgófázisként, a C18 oszlop állófázisán lévő hosszú szénlánc hajlamos elkerülni a vizet és keveredni egymással, ami azonnali csökkenést eredményez. az oszlop retenciós képessége, vagy akár nincs visszatartás.Ezt a jelenséget „hidrofób fázis-összeomlásnak” nevezik (ahogy az 1. ábra bal oldalán látható).Bár ez a helyzet visszafordítható, ha az oszlopot szerves oldószerekkel, például metanollal vagy acetonitrillel mossuk, mégis károsíthatja az oszlopot.Ezért meg kell akadályozni ennek a helyzetnek a bekövetkezését.
1. ábra: A kötött fázisok sematikus diagramja a szilikagél felületén normál C18 oszlopban (balra) és C18AQ oszlopban (jobbra).
A fent említett problémák megoldása érdekében a kromatográfiás csomagolóanyagok gyártói műszaki fejlesztéseket hajtottak végre.Az egyik ilyen fejlesztés a szilícium-dioxid mátrix felületének módosítása, például hidrofil cianocsoportok bevezetése (ahogyan az 1. ábra jobb oldalán látható), hogy a szilikagél felületét hidrofilebbé tegyék.Így a szilícium-dioxid felületén lévő C18 láncok erősen vizes körülmények között teljesen meghosszabbíthatók, és elkerülhető volt a hidrofób fázis összeomlása.Ezeket a módosított C18 oszlopokat vizes C18 oszlopoknak nevezzük, nevezetesen C18AQ oszlopoknak, amelyeket erősen vizes elúciós körülményekre terveztek, és 100%-os vizes rendszert is elviselnek.A C18AQ oszlopokat széles körben alkalmazzák erős poláris vegyületek, köztük szerves savak, peptidek, nukleozidok és vízoldható vitaminok elválasztására és tisztítására.
A sómentesítés a C18AQ oszlopok egyik tipikus alkalmazása a minták gyorstisztításában, amely eltávolítja a sót vagy a pufferkomponenseket a minta oldószerében, hogy megkönnyítse a minta felhasználását a későbbi vizsgálatok során.Ebben a bejegyzésben az erős polaritású Brilliant Blue FCF-et használtuk mintaként, és C18AQ oszlopon tisztítottuk.A minta oldószerét pufferoldatból szerves oldószerrel helyettesítettük, ezzel megkönnyítve a következő rotációs bepárlást, valamint oldószert és üzemidőt takarítva meg.Továbbá a minta tisztasága javult a mintában lévő szennyeződések eltávolításával.
Kísérleti szakasz
2. ábra A minta kémiai szerkezete.
Ebben a bejegyzésben a Brilliant Blue FCF-et használtuk mintaként.A nyers minta tisztasága 86%-os volt, a minta kémiai szerkezetét a 2. ábra mutatja. A mintaoldat elkészítéséhez 300 mg porszerű nyers Brilliant Blue FCF szilárd anyagot 1 M NaH2PO4 pufferoldatban oldottunk, és alaposan összeráztuk. teljesen tiszta megoldás.A mintaoldatot ezután egy injektorral a flash oszlopba fecskendeztük.A gyors tisztítás kísérleti beállításait az 1. táblázat tartalmazza.
| Hangszer | SepaBean™ gép2 | |||
| Patronok | 12 g-os SepaFlash C18 RP vakupatron (gömb alakú szilícium-dioxid, 20 - 45 μm, 100 Å, Rendelési szám: SW-5222-012-SP) | 12 g-os SepaFlash C18AQ RP vakupatron (gömb alakú szilícium-dioxid, 20-45 μm, 100 Å, rendelési szám: SW-5222-012-SP(AQ))) | ||
| Hullámhossz | 254 nm | |||
| Mobil fázis | Oldószer A: víz B oldószer: metanol | |||
| Áramlási sebesség | 30 ml/perc | |||
| Minta betöltés | 300 mg (Brilliant Blue FCF 86%-os tisztasággal) | |||
| Gradiens | Idő (CV) | B oldószer (%) | Idő (CV) | B oldószer (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Eredmények és megbeszélés
A minták sómentesítéséhez és tisztításához SepaFlash C18AQ RP flash kazettát használtunk.Lépcsős gradienst használtunk, amelyben tiszta vizet használtunk mozgófázisként az elúció kezdetén, és 10 oszloptérfogaton (CV) futtattuk.A 3. ábrán látható módon, ha tiszta vizet használtunk mozgófázisként, a minta teljesen megmaradt a flash kazettán.Ezután a metanolt a mozgófázisban közvetlenül 100%-ra növeltük, és a gradienst 7,5 CV-ig tartottuk.A minta 11,5 és 13,5 CV között eluálódott.Az összegyűjtött frakciókban a mintaoldatot NaH2PO4 pufferoldatról metanolra cseréltük.Az erősen vizes oldattal összehasonlítva a metanolt sokkal könnyebb volt eltávolítani rotációs bepárlással a következő lépésben, ami megkönnyíti a következő kutatást.
3. ábra. A minta flash kromatogramja C18AQ kazettán.
A C18AQ kazetta és a normál C18 kazetta visszatartási viselkedésének összehasonlítására erős polaritású minták esetén párhuzamos összehasonlítási tesztet végeztünk.SepaFlash C18 RP flash kazettát használtunk, és a minta flash kromatogramja a 4. ábrán látható. A normál C18 patronok esetében a legmagasabb tolerálható vizes fázisarány körülbelül 90%.Ezért a kiindulási gradienst 10% metanol/90% vízre állítottuk be.Amint a 4. ábrán látható, a C18-láncok hidrofób fázis-összeomlása miatt, amelyet a nagy vizes arány okoz, a minta alig maradt vissza a normál C18-kazettán, és a mozgófázis közvetlenül eluálta.Emiatt a minta sótalanítása vagy tisztítása nem fejezhető be.
4. ábra: A minta flash kromatogramja egy normál C18 kazettán.
A lineáris gradienshez képest a lépcsős gradiens használatának a következő előnyei vannak:
1. Csökken az oldószerhasználat és a mintatisztítás futási ideje.
2. A céltermék éles csúcsban eluálódik, ami csökkenti az összegyűjtött frakciók térfogatát, és így megkönnyíti a következő forgó bepárlást, valamint időt takarít meg.
3. Az összegyűjtött termék metanolban van, amely könnyen elpárologtatható, így csökken a száradási idő.
Összefoglalva, az erősen poláris vagy erősen hidrofil minta tisztítására a SepaFlash C18AQ RP flash patronok a SepaBean™ Machine preparatív flash kromatográfiás rendszerrel kombinálva gyors és hatékony megoldást kínálhatnak.
A SepaFlash Bonded Series C18 RP vakupatronokról
A SepaFlash C18AQ RP vakupatronok sorozata a Santai Technologytól eltérő specifikációkkal rendelkezik (lásd a 2. táblázatot).
| Cikkszám | Oszlopméret | Áramlási sebesség (ml/perc) | Max. Nyomás (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
2. táblázat: SepaFlash C18AQ RP vakupatronok.
Csomagolóanyagok: Nagy hatékonyságú gömb alakú C18(AQ)-kötésű szilícium-dioxid, 20 - 45 μm, 100 Å.
logika (a 2. táblázat szerint).
Feladás időpontja: 2018. augusztus 27