Rui Huang, Bo Xu
Centar za istraživanje i razvoj aplikacija
Uvod
Peptid je spoj sastavljen od aminokiselina, od kojih svaka ima jedinstvena fizikalna i kemijska svojstva zbog različitih vrsta i redoslijeda aminokiselinskih ostataka koji čine njen slijed.S razvojem kemijske sinteze čvrste faze, kemijska sinteza različitih aktivnih peptida je postigla veliki napredak.Međutim, zbog kompliciranog sastava peptida dobivenog sintezom na čvrstoj fazi, konačni proizvod treba pročistiti pouzdanim metodama odvajanja.Često korištene metode pročišćavanja peptida uključuju kromatografiju ionske izmjene (IEC) i tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti reverzne faze (RP-HPLC), čiji su nedostaci mali kapacitet punjenja uzorka, visoka cijena medija za odvajanje, komplicirana i skupa oprema za odvajanje, itd. Za brzo pročišćavanje peptida malih molekula (MW < 1 kDa), slučaj uspješne primjene prethodno je objavio Santai Technologies, u kojem je uložak SepaFlash RP C18 korišten za brzo pročišćavanje timopentina (TP-5) i dobiven je ciljni proizvod koji zadovoljava zahtjeve.
Slika 1. 20 uobičajenih aminokiselina (reproducirano s www.bachem.com).
Postoji 20 vrsta aminokiselina koje su uobičajene u sastavu peptida.Te se aminokiseline mogu podijeliti u sljedeće skupine prema njihovoj polarnosti i kiselo-baznom svojstvu: nepolarne (hidrofobne), polarne (bez naboja), kisele ili bazične (kao što je prikazano na slici 1).U peptidnoj sekvenci, ako su aminokiseline koje čine sekvencu uglavnom polarne (kao što je označeno ružičastom bojom na slici 1), kao što su cistein, glutamin, asparagin, serin, treonin, tirozin, itd. tada bi ovaj peptid mogao imati snažan polaritet i biti visoko topljivi u vodi.Tijekom postupka pročišćavanja za ove jake uzorke polarnih peptida kromatografijom reverzne faze dogodit će se fenomen koji se naziva kolaps hidrofobne faze (pogledajte prethodno objavljenu bilješku o aplikaciji tvrtke Santai Technologies: kolaps hidrofobne faze, AQ kolone kromatografije reverzne faze i njihove primjene).U usporedbi s običnim kolonama C18, poboljšane kolone C18AQ najprikladnije su za pročišćavanje jakih polarnih ili hidrofilnih uzoraka.U ovom postu, jaki polarni peptid korišten je kao uzorak i pročišćen na C18AQ koloni.Kao rezultat, dobiven je ciljni proizvod koji zadovoljava zahtjeve i može se koristiti u daljnjim istraživanjima i razvoju.
| Instrument | SepaBean™stroj 2 | |||
| patrone | 12 g SepaFlash C18 RP bljeskalica (sferični silicij, 20 - 45 μm, 100 Å, broj za narudžbu: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash patrona (sferični silicij, 20 - 45 μm, 100 Å, broj narudžbe: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Valna duljina | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobilna faza | Otapalo A: Voda Otapalo B: acetonitril | |||
| Protok | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Učitavanje uzorka | 30 mg | |||
| Gradijent | Vrijeme (CV) | Otapalo B (%) | Vrijeme (min) | Otapalo B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Rezultati i rasprava
Za usporedbu učinka pročišćavanja uzorka polarnog peptida između obične kolone C18 i kolone C18AQ, za početak smo upotrijebili običnu kolonu C18 za brzo pročišćavanje uzorka.Kao što je prikazano na slici 2, zbog kolapsa hidrofobne faze lanaca C18 uzrokovanog visokim omjerom vode, uzorak se jedva zadržao na običnom ulošku C18 i izravno je eluiran mobilnom fazom.Kao rezultat toga, uzorak nije bio učinkovito odvojen i pročišćen.
Slika 2. Flash kromatogram uzorka na običnom C18 ulošku.
Zatim smo upotrijebili kolonu C18AQ za brzo pročišćavanje uzorka.Kao što je prikazano na slici 3, peptid je učinkovito zadržan na stupcu i zatim eluiran.Ciljani proizvod je odvojen od nečistoća u sirovom uzorku i sakupljen.Nakon liofilizacije i zatim analize HPLC-om, pročišćeni proizvod ima čistoću od 98,2% i može se dalje koristiti za sljedeći korak istraživanja i razvoja.
Slika 3. Flash kromatogram uzorka na C18AQ ulošku.
Zaključno, flash patrona SepaFlash C18AQ RP u kombinaciji sa sustavom flash kromatografije SepaBean™stroj može ponuditi brzo i učinkovito rješenje za pročišćavanje jakih polarnih ili hidrofilnih uzoraka.
Postoji serija SepaFlash C18AQ RP flash patrona s različitim specifikacijama tvrtke Santai Technology (kao što je prikazano u tablici 2).
| Broj predmeta | Veličina stupca | Protok (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 (prikaz, ostalo). | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 (prikaz, ostalo). | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 (prikaz, ostalo). | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 (prikaz, stručni). | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 (prikaz, ostalo). | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 (prikaz, stručni). | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 (prikaz, stručni). | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 (prikaz, stručni). | 250/17.2 |
Tablica 2. SepaFlash C18AQ RP flash patrone.Materijali za pakiranje: visokoučinkoviti sferični C18(AQ)-vezan silicij, 20 - 45 μm, 100 Å.
Za daljnje informacije o detaljnim specifikacijama uređaja SepaBean™ ili informacije o naručivanju bljeskalica serije SepaFlash posjetite našu web stranicu.
Vrijeme objave: 12. listopada 2018