Hongcheng Wang, bo xu
Centar za istraživanje i razvoj prijave
Uvod
Prema relativnim polaritetima stacionarne faze i mobilne faze, tekuća kromatografija se može podijeliti u normalnu faznu kromatografiju (NPC) i obrnutu faznu kromatografiju (RPC). Za RPC je polaritet mobilne faze jača od one u nepomičnoj fazi. RPC je postao najčešće korišteni u načinima razdvajanja tekuće kromatografije zbog svoje visoke učinkovitosti, dobre rezolucije i jasnog mehanizma zadržavanja. Stoga je RPC prikladan za odvajanje i pročišćavanje različitih polarnih ili nepolarnih spojeva, uključujući alkaloide, ugljikohidrate, masne kiseline, steroide, nukleinske kiseline, aminokiseline, peptide, proteine, itd. U RPC-u, najobičnija je stacionarna faza matrix koja je silicije Cyano, Amino itd. Među tim vezanim funkcionalnim skupinama, najčešće se koristi C18. Procjenjuje se da više od 80% RPC -a sada koristi C18 vezanu fazu. Stoga je stupac C18 kromatografije postao neophodan univerzalni stupac za svaki laboratorij.
Iako se C18 stupac može koristiti u vrlo širokom rasponu aplikacija, za neke uzorke koji su vrlo polarni ili visoko hidrofilni, redoviti C18 stupci mogu imati problema kada se koriste za pročišćavanje takvih uzoraka. U RPC -u se obično korištena otapala elucije mogu naručiti u skladu s njihovom polaritetom: voda <metanol <acetonitril <etanol <tetrahidrofuran <izopropanol. Da bi se osiguralo dobro zadržavanje na stupcu za ove uzorke (jaka polarna ili visoko hidrofilna), potreban je visok udio vodenog sustava da bi se koristio kao mobilna faza. Međutim, kada koristite čistu vodu (uključujući čistu vodu ili čistu otopinu soli) kao mobilnu fazu, dugi ugljični lanac na stacionarnoj fazi C18 stupca ima tendenciju da izbjegava vodu i miješa jedni s drugima, što rezultira trenutačnim smanjenjem zadržavanja kapaciteta stupca ili čak bez zadržavanja. Taj se fenomen naziva "kolaps hidrofobne faze" (kao što je prikazano na lijevom dijelu slike 1). Iako je ova situacija reverzibilna kada se stupac ispire organskim otapalima kao što su metanol ili acetonitril, ona još uvijek može prouzrokovati oštećenje stupca. Stoga je potrebno spriječiti da se ta situacija dogodi.
Slika 1. Shematski dijagram vezanih faza na površini silikagela u redovnom C18 stupcu (lijevo) i C18AQ stupcu (desno).
Da bi riješili gore navedene probleme, proizvođači materijala za pakiranje kromatografskih pakiranja napravili su tehnička poboljšanja. Jedno od tih poboljšanja je izrada nekih modifikacija na površini matrice silicijevog dioksida, poput uvođenja hidrofilnih cijano skupina (kao što je prikazano na desnom dijelu slike 1), kako bi se površina silika gela učinila hidrofilnijim. Stoga bi se C18 lanci na površini silicijevog dioksida mogu u potpunosti proširiti u vrlo vodenim uvjetima i može se izbjeći kolaps hidrofobne faze. Ovi modificirani C18 stupci nazivaju se vodeni C18 stupci, naime C18AQ stupci, koji su dizajnirani za visoko vodene uvjete elucije i mogu tolerirati 100% vodeni sustav. C18AQ stupci široko su primijenjeni u odvajanju i pročišćavanju jakih polarnih spojeva, uključujući organske kiseline, peptide, nukleozide i vitamine topljive u vodi.
Desaliranje je jedna od tipičnih primjena C18AQ stupaca u pročišćavanju bljeskalice za uzorke, koja uklanja komponente soli ili međuspremnika u uzorku otapala kako bi se olakšala primjena uzorka u sljedećim studijama. U ovom postu, sjajni plavi FCF s jakim polarnošću korišten je kao uzorak i pročišćen na C18AQ stupcu. Uzorak otapala zamijenjeno je organskim otapalom iz otopine pufera, što je olakšalo sljedeće rotacijsko isparavanje, kao i uštedu otapala i radnog vremena. Nadalje, čistoća uzorka poboljšana je uklanjanjem nekih nečistoća u uzorku.
Eksperimentalni odjeljak
Slika 2. Kemijska struktura uzorka.
Sjajno plavi FCF korišten je kao uzorak u ovom postu. Čistoća sirovog uzorka bila je 86%, a kemijska struktura uzorka prikazana je na slici 2. za pripremu otopine uzorka, 300 mg praškaste sirove tvari kruta kruta od sjajnog plavog FCF -a otopljena je u 1 M NAH2PO4 puferskoj otopini i dobro se tresla kako bi postala potpuno jasna otopina. Otopina uzorka zatim je ubrizgavanje u stupac bljeskalice injektorom. Eksperimentalno postavljanje bljeskalice navedeno je u tablici 1.
| Instrument | Sepabean ™ stroj2 | |||
| Patrone | 12 G Sepaflash C18 RP Flash uložak (sferni silicij, 20-45 µm, 100 Å, Broj narudžbe: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash uložak (sferni silicij, 20-45 µm, 100 Å, broj narudžbe: SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Valna duljina | 254 nm | |||
| Mobilna faza | Otapalo a: voda Otapalo b: Metanol | |||
| Brzina protoka | 30 ml/min | |||
| Umetanje uzorka | 300 mg (sjajno plavi FCF s čistoćom od 86%) | |||
| Gradijent | Vrijeme (CV) | Otapalo b (%) | Vrijeme (CV) | Otapalo b (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultati i rasprava
SEPAFLASH C18AQ RP bljeskalica korišten je za uzorkovanje i pročišćavanje. Korišteni gradijent je korišten u kojem je čista voda korištena kao mobilna faza na početku elucije i pokrenuta za 10 volumena stupaca (CV). Kao što je prikazano na slici 3, kada se koristi čista voda kao mobilna faza, uzorak je u potpunosti zadržan na flash ulošku. Zatim je metanol u mobilnoj fazi izravno povećan na 100%, a gradijent je održan za 7,5 CV. Uzorak je eluiran od 11,5 do 13,5 cv. U prikupljenim frakcijama, otopina uzorka zamijenjena je iz otopine pufera NAH2PO4 u metanol. U usporedbi s vrlo vodenom otopinom, metanol je bilo mnogo lakše ukloniti rotacijskom isparavanjem u sljedećem koraku, što olakšava sljedeće istraživanje.
Slika 3. Flash kromatogram uzorka na C18AQ uloškom.
Da bi se uspoređivalo retencijsko ponašanje C18AQ uložaka i redovnog C18 uloška za uzorke jake polarnosti, provedena je paralelna usporedna test. Upotrijebljen je Flash uložak od C18 RP, a flash kromatogram za uzorak prikazan je na slici 4. za redovne patrone C18, najveći tolerirani omjer vodene faze je oko 90%. Stoga je startni gradijent postavljen na 10% metanol u 90% vode. Kao što je prikazano na slici 4, zbog kolapsa hidrofobne faze lanaca C18 uzrokovanih visokim vodenim omjerom, uzorak je jedva zadržan na redovnom uloškom C18 i izravno je eluiran u mobilnoj fazi. Kao rezultat, rad uzorka desaliranja ili pročišćavanja ne može se dovršiti.
Slika 4. Flash kromatogram uzorka na redovnom C18 ulošku.
U usporedbi s linearnim gradijentom, upotreba gradijenta koraka ima sljedeće prednosti:
1. Upotreba otapala i vrijeme pokretanja za pročišćavanje uzorka se smanjuje.
2. Ciljni proizvod eluira na oštrom vrhu, što smanjuje volumen prikupljenih frakcija i na taj način olakšava sljedeće rotacijsko isparavanje kao i uštedu vremena.
3. Prikupljeni proizvod je u metanolu koji je lako ispariti, pa se vrijeme sušenja smanjuje.
Zaključno, za pročišćavanje uzorka koji je snažno polarni ili visoko hidrofilni, sepaflash c18aq RP flash patroni koji se kombiniraju s pripremnim flash kromatografskim strojem Sepabean ™ stroj može ponuditi brzo i učinkovito rješenje.
O serijskom seriji serija C18 RP bljeskalice
Postoji niz sepaflash C18AQ RP flash spremnika s različitim specifikacijama iz Santai tehnologije (kao što je prikazano u tablici 2).
| Broj stavke | Veličina stupca | Brzina protoka (ml/min) | Maksimum (PSI/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tablica 2. Sepaflash C18AQ RP bljeskalice.
Materijali za pakiranje: sferni sferni C18 (aq)-silicijeni dioksid, 20-45 µm, 100 Å.
Logiy (kao što je prikazano u tablici 2).
Post Vrijeme: kolovoz-27-2018