Hongcheng Wang, Bo Xu
Centar za istraživanje i razvoj aplikacija
Uvod
Prema relativnim polaritetima stacionarne i mobilne faze, tekućinska kromatografija se može podijeliti na kromatografiju normalne faze (NPC) i kromatografiju reverzne faze (RPC).Za RPC, polaritet mobilne faze je jači od polariteta stacionarne faze.RPC je postao najčešće korišten u načinima odvajanja tekućinskom kromatografijom zbog svoje visoke učinkovitosti, dobre rezolucije i jasnog mehanizma zadržavanja.Stoga je RPC prikladan za odvajanje i pročišćavanje raznih polarnih ili nepolarnih spojeva, uključujući alkaloide, ugljikohidrate, masne kiseline, steroide, nukleinske kiseline, aminokiseline, peptide, proteine itd. U RPC-u, najčešće korištena stacionarna faza je matrica silika gela koja je vezana s različitim funkcionalnim skupinama, uključujući C18, C8, C4, fenil, cijano, amino, itd. Među tim vezanim funkcionalnim skupinama, najčešće korištena je C18.Procjenjuje se da više od 80% RPC-a sada koristi C18 vezanu fazu.Stoga je kolona za kromatografiju C18 postala univerzalna kolona koju mora imati svaki laboratorij.
Iako se stupac C18 može koristiti u vrlo širokom rasponu primjena, međutim, za neke uzorke koji su vrlo polarni ili visoko hidrofilni, obični stupci C18 mogu imati problema kada se koriste za pročišćavanje takvih uzoraka.U RPC-u, uobičajeno korištena otapala za ispiranje mogu se poredati prema njihovom polaritetu: voda < metanol < acetonitril < etanol < tetrahidrofuran < izopropanol.Kako bi se osiguralo dobro zadržavanje na stupcu za ove uzorke (jako polarne ili visoko hidrofilne), potreban je visok udio vodenog sustava koji se koristi kao mobilna faza.Međutim, kada se koristi sustav čiste vode (uključujući čistu vodu ili čistu otopinu soli) kao mobilnu fazu, dugi lanac ugljika na stacionarnoj fazi kolone C18 nastoji izbjeći vodu i međusobno se miješati, što rezultira trenutnim smanjenjem u retencijskog kapaciteta kolone ili čak bez retencije.Ovaj fenomen se naziva "kolaps hidrofobne faze" (kao što je prikazano u lijevom dijelu slike 1).Iako je ova situacija reverzibilna kada se kolona ispere organskim otapalima kao što su metanol ili acetonitril, još uvijek može uzrokovati oštećenje kolone.Stoga je potrebno spriječiti da se ova situacija dogodi.
Slika 1. Shematski dijagram vezanih faza na površini silika gela u redovnoj koloni C18 (lijevo) i koloni C18AQ (desno).
Kako bi riješili gore navedene probleme, proizvođači materijala za kromatografsko pakiranje napravili su tehnička poboljšanja.Jedno od tih poboljšanja je izvođenje nekih modifikacija na površini silika matrice, kao što je uvođenje hidrofilnih cijano skupina (kao što je prikazano u desnom dijelu slike 1), kako bi se površina silika gela učinila hidrofilnijom.Tako bi se lanci C18 na površini silicijevog dioksida mogli u potpunosti produžiti u uvjetima visoke razine vode, a kolaps hidrofobne faze mogao bi se izbjeći.Ove modificirane C18 kolone nazivaju se vodene C18 kolone, naime C18AQ kolone, koje su dizajnirane za uvjete eluiranja s visokom razinom vode i mogu tolerirati 100% vodeni sustav.Kolone C18AQ naširoko se primjenjuju u odvajanju i pročišćavanju jakih polarnih spojeva, uključujući organske kiseline, peptide, nukleozide i vitamine topive u vodi.
Odsoljavanje je jedna od tipičnih primjena kolona C18AQ u brzom pročišćavanju uzoraka, čime se uklanjaju komponente soli ili pufera u otapalu uzorka kako bi se olakšala primjena uzorka u sljedećim studijama.U ovom postu, Brilliant Blue FCF s jakim polaritetom korišten je kao uzorak i pročišćen na koloni C18AQ.Otapalo uzorka zamijenjeno je organskim otapalom iz puferske otopine, čime je olakšano sljedeće rotacijsko isparavanje, kao i ušteda otapala i radnog vremena.Nadalje, čistoća uzorka je poboljšana uklanjanjem nekih nečistoća u uzorku.
Eksperimentalni odjel
Slika 2. Kemijska struktura uzorka.
Brilliant Blue FCF korišten je kao uzorak u ovom postu.Čistoća sirovog uzorka bila je 86%, a kemijska struktura uzorka prikazana je na slici 2. Za pripremu otopine uzorka, 300 mg praškaste sirove krute tvari Brilliant Blue FCF otopljeno je u 1 M otopini pufera NaH2PO4 i dobro protreseno da postane potpuno jasno rješenje.Otopina uzorka je zatim injektorom ubrizgana u flash kolonu.Eksperimentalna postavka brzog pročišćavanja navedena je u tablici 1.
| Instrument | SepaBean™ stroj2 | |||
| patrone | 12 g SepaFlash C18 RP flash patrona (sferični silicij, 20 - 45 μm, 100 Å, broj narudžbe: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash patrona (sferični silicij, 20 - 45 μm, 100 Å, broj narudžbe: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Valna duljina | 254 nm | |||
| Mobilna faza | Otapalo A: voda Otapalo B: metanol | |||
| Protok | 30 ml/min | |||
| Učitavanje uzorka | 300 mg (Brilliant Blue FCF čistoće 86%) | |||
| Gradijent | Vrijeme (CV) | Otapalo B (%) | Vrijeme (CV) | Otapalo B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultati i rasprava
SepaFlash C18AQ RP flash patrona korištena je za odsoljavanje i pročišćavanje uzorka.Korišten je stupnjeviti gradijent u kojem je čista voda korištena kao mobilna faza na početku eluiranja i izvođena za 10 volumena kolone (CV).Kao što je prikazano na slici 3, kada se koristi čista voda kao mobilna faza, uzorak je u potpunosti zadržan na fleš ulošku.Zatim je metanol u mobilnoj fazi izravno povećan na 100%, a gradijent je održavan na 7,5 CV.Uzorak je eluiran od 11,5 do 13,5 CV.U sakupljenim frakcijama, otopina uzorka je zamijenjena otopinom pufera NaH2PO4 metanolom.U usporedbi s visoko vodenom otopinom, metanol je bilo puno lakše ukloniti rotacijskim isparavanjem u sljedećem koraku, što olakšava sljedeća istraživanja.
Slika 3. Flash kromatogram uzorka na C18AQ ulošku.
Kako bi se usporedilo ponašanje zadržavanja C18AQ uloška i običnog C18 uloška za uzorke jakog polariteta, proveden je paralelni usporedni test.Korišten je flash uložak SepaFlash C18 RP, a flash kromatogram za uzorak prikazan je na slici 4. Za obične C18 uloške, najveći tolerirani omjer vodene faze je oko 90%.Stoga je početni gradijent postavljen na 10% metanola u 90% vode.Kao što je prikazano na slici 4, zbog kolapsa hidrofobne faze lanaca C18 uzrokovanog visokim omjerom vode, uzorak se jedva zadržao na običnom ulošku C18 i izravno je eluiran mobilnom fazom.Kao rezultat toga, operacija odsoljavanja ili pročišćavanja uzorka ne može se dovršiti.
Slika 4. Flash kromatogram uzorka na običnom C18 ulošku.
U usporedbi s linearnim gradijentom, korištenje stepenastog gradijenta ima sljedeće prednosti:
1. Smanjeno je korištenje otapala i vrijeme rada za pročišćavanje uzorka.
2. Ciljani produkt eluira s oštrim vrhom, što smanjuje volumen sakupljenih frakcija i na taj način olakšava sljedeće rotacijsko isparavanje, kao i uštedu vremena.
3. Sakupljeni proizvod je u metanolu koji se lako isparava, čime se smanjuje vrijeme sušenja.
Zaključno, za pročišćavanje uzorka koji je jako polaran ili visoko hidrofilan, SepaFlash C18AQ RP flash patrone u kombinaciji sa sustavom preparativne flash kromatografije SepaBean™ Machine mogu ponuditi brzo i učinkovito rješenje.
O SepaFlash Bonded Series C18 RP bljeskalicama
Postoji serija SepaFlash C18AQ RP flash patrona s različitim specifikacijama tvrtke Santai Technology (kao što je prikazano u tablici 2).
| Broj predmeta | Veličina stupca | Protok (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 (prikaz, ostalo). | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 (prikaz, ostalo). | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 (prikaz, ostalo). | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 (prikaz, stručni). | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 (prikaz, ostalo). | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 (prikaz, stručni). | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 (prikaz, ostalo). | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 (prikaz, ostalo). | 250/17.2 |
Tablica 2. SepaFlash C18AQ RP flash patrone.
Materijali za pakiranje: visokoučinkoviti sferični C18(AQ)-vezan silicij, 20 - 45 μm, 100 Å.
logiju (kao što je prikazano u tablici 2).
Vrijeme objave: 27. kolovoza 2018