હોંગચેંગ વાંગ, બો ઝુ
એપ્લિકેશન આર એન્ડ ડી સેન્ટર
પરિચય
સ્થિર તબક્કા અને મોબાઇલ તબક્કાની સંબંધિત ધ્રુવીયતા અનુસાર, પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફીને સામાન્ય તબક્કા ક્રોમેટોગ્રાફી (NPC) અને વિપરીત તબક્કા ક્રોમેટોગ્રાફી (RPC)માં વિભાજિત કરી શકાય છે.RPC માટે, મોબાઇલ તબક્કાની ધ્રુવીયતા સ્થિર તબક્કા કરતા વધુ મજબૂત છે.RPC તેની ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા, સારા રિઝોલ્યુશન અને સ્પષ્ટ રીટેન્શન મિકેનિઝમને કારણે લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી સેપરેશન મોડ્સમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતું એક બની ગયું છે.તેથી આરપીસી વિવિધ ધ્રુવીય અથવા બિન-ધ્રુવીય સંયોજનોના વિભાજન અને શુદ્ધિકરણ માટે યોગ્ય છે, જેમાં આલ્કલોઇડ્સ, કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ, ફેટી એસિડ્સ, સ્ટેરોઇડ્સ, ન્યુક્લિક એસિડ્સ, એમિનો એસિડ્સ, પેપ્ટાઇડ્સ, પ્રોટીન વગેરેનો સમાવેશ થાય છે. આરપીસીમાં, સૌથી સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા સ્થિર તબક્કા છે. સિલિકા જેલ મેટ્રિક્સ જે C18, C8, C4, ફિનાઇલ, સાયનો, એમિનો, વગેરે સહિત વિવિધ કાર્યાત્મક જૂથો સાથે બંધાયેલ છે. આ બંધાયેલા કાર્યાત્મક જૂથોમાં, સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતું એક C18 છે.એવો અંદાજ છે કે RPC ના 80% થી વધુ હવે C18 બોન્ડેડ તબક્કાનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છે.તેથી C18 ક્રોમેટોગ્રાફી કૉલમ દરેક લેબોરેટરી માટે અનિવાર્યપણે સાર્વત્રિક કૉલમ બની ગઈ છે.
જોકે C18 કૉલમનો ઉપયોગ ખૂબ જ વિશાળ શ્રેણીમાં થઈ શકે છે, તેમ છતાં, કેટલાક નમૂનાઓ માટે કે જે ખૂબ જ ધ્રુવીય અથવા અત્યંત હાઇડ્રોફિલિક છે, આવા નમૂનાઓને શુદ્ધ કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી વખતે નિયમિત C18 કૉલમમાં સમસ્યા આવી શકે છે.આરપીસીમાં, સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા ઇલ્યુશન સોલવન્ટને તેમની ધ્રુવીયતા અનુસાર ઓર્ડર કરી શકાય છે: પાણી < મિથેનોલ < એસેટોનાઇટ્રાઇલ < ઇથેનોલ < ટેટ્રાહાઇડ્રોફ્યુરાન < આઇસોપ્રોપાનોલ.આ નમૂનાઓ (મજબૂત ધ્રુવીય અથવા ઉચ્ચ હાઇડ્રોફિલિક) માટે સ્તંભ પર સારી જાળવણીની ખાતરી કરવા માટે, જલીય પ્રણાલીના ઉચ્ચ પ્રમાણનો મોબાઇલ તબક્કા તરીકે ઉપયોગ કરવો જરૂરી છે.જો કે, મોબાઇલ તબક્કા તરીકે શુદ્ધ પાણીની વ્યવસ્થા (શુદ્ધ પાણી અથવા શુદ્ધ મીઠાના દ્રાવણ સહિત)નો ઉપયોગ કરતી વખતે, C18 કૉલમના સ્થિર તબક્કા પરની લાંબી કાર્બન સાંકળ પાણીને ટાળવા અને એકબીજા સાથે ભળી જવાનું વલણ ધરાવે છે, પરિણામે ત્વરિત ઘટાડો થાય છે. કૉલમની રીટેન્શન ક્ષમતા અથવા તો કોઈ રીટેન્શન નથી.આ ઘટનાને "હાઈડ્રોફોબિક ફેઝ કોલેપ્સ" કહેવામાં આવે છે (આકૃતિ 1 ના ડાબા ભાગમાં બતાવ્યા પ્રમાણે).જો કે આ સ્થિતિ ઉલટાવી શકાય તેવી હોય છે જ્યારે સ્તંભને મિથેનોલ અથવા એસેટોનાઈટ્રાઈલ જેવા કાર્બનિક દ્રાવકોથી ધોવામાં આવે છે, તેમ છતાં તે સ્તંભને નુકસાન પહોંચાડી શકે છે.તેથી, આ સ્થિતિને બનતી અટકાવવી જરૂરી છે.
આકૃતિ 1. નિયમિત C18 કૉલમ (ડાબે) અને C18AQ કૉલમ (જમણે) માં સિલિકા જેલની સપાટી પર બંધાયેલા તબક્કાઓની યોજનાકીય રેખાકૃતિ.
ઉપરોક્ત સમસ્યાઓના નિવારણ માટે, ક્રોમેટોગ્રાફિક પેકિંગ સામગ્રીના ઉત્પાદકોએ તકનીકી સુધારાઓ કર્યા છે.આમાંનો એક સુધારો સિલિકા મેટ્રિક્સની સપાટી પર કેટલાક ફેરફારો કરી રહ્યો છે, જેમ કે સિલિકા જેલની સપાટીને વધુ હાઇડ્રોફિલિક બનાવવા માટે હાઇડ્રોફિલિક સાયનો જૂથો (આકૃતિ 1 ના જમણા ભાગમાં બતાવ્યા પ્રમાણે) ની રજૂઆત.આમ સિલિકા સપાટી પરની C18 સાંકળો અત્યંત જલીય સ્થિતિમાં સંપૂર્ણ રીતે વિસ્તૃત થઈ શકે છે અને હાઈડ્રોફોબિક તબક્કાના પતનને ટાળી શકાય છે.આ સંશોધિત C18 કૉલમ્સને જલીય C18 કૉલમ કહેવામાં આવે છે, એટલે કે C18AQ કૉલમ, જે અત્યંત જલીય ઉત્સર્જનની સ્થિતિ માટે રચાયેલ છે અને 100% જલીય પ્રણાલીને સહન કરી શકે છે.કાર્બનિક એસિડ, પેપ્ટાઇડ્સ, ન્યુક્લિયોસાઇડ્સ અને પાણીમાં દ્રાવ્ય વિટામિન્સ સહિત મજબૂત ધ્રુવીય સંયોજનોના વિભાજન અને શુદ્ધિકરણમાં C18AQ કૉલમ વ્યાપકપણે લાગુ કરવામાં આવ્યા છે.
ડિસેલ્ટિંગ એ નમૂનાઓ માટે ફ્લેશ શુદ્ધિકરણમાં C18AQ કૉલમ્સની લાક્ષણિક એપ્લિકેશનમાંની એક છે, જે પછીના અભ્યાસોમાં નમૂનાના ઉપયોગને સરળ બનાવવા માટે નમૂનાના દ્રાવકમાં મીઠું અથવા બફર ઘટકોને દૂર કરે છે.આ પોસ્ટમાં, મજબૂત ધ્રુવીયતા સાથે બ્રિલિયન્ટ બ્લુ FCF નો નમૂના તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો અને C18AQ કૉલમ પર શુદ્ધ કરવામાં આવ્યો હતો.સેમ્પલ સોલવન્ટને બફર સોલ્યુશનમાંથી ઓર્ગેનિક દ્રાવક દ્વારા બદલવામાં આવ્યું હતું, આમ નીચેના રોટરી બાષ્પીભવન તેમજ દ્રાવક અને કાર્યકારી સમયની બચત કરવામાં મદદ મળે છે.વધુમાં, નમૂનામાં કેટલીક અશુદ્ધિઓ દૂર કરીને નમૂનાની શુદ્ધતામાં સુધારો કરવામાં આવ્યો હતો.
પ્રાયોગિક વિભાગ
આકૃતિ 2. નમૂનાનું રાસાયણિક માળખું.
આ પોસ્ટમાં બ્રિલિયન્ટ બ્લુ FCF નો નમૂના તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.કાચા નમૂનાની શુદ્ધતા 86% હતી અને નમૂનાનું રાસાયણિક માળખું આકૃતિ 2 માં બતાવવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાનું સોલ્યુશન તૈયાર કરવા માટે, 300 મિલિગ્રામ પાવડરી ક્રૂડ સોલિડ ઓફ બ્રિલિયન્ટ બ્લુ FCF 1 M NaH2PO4 બફર સોલ્યુશનમાં ઓગળવામાં આવ્યું હતું અને સારી રીતે હલાવીને તે બની ગયું હતું. સંપૂર્ણપણે સ્પષ્ટ ઉકેલ.પછી સેમ્પલ સોલ્યુશનને ઇન્જેક્ટર દ્વારા ફ્લેશ કોલમમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું.ફ્લેશ શુદ્ધિકરણનું પ્રાયોગિક સેટઅપ કોષ્ટક 1 માં સૂચિબદ્ધ છે.
| સાધન | SepaBean™ મશીન2 | |||
| કારતુસ | 12 g SepaFlash C18 RP ફ્લેશ કારતૂસ (ગોળાકાર સિલિકા, 20 - 45 μm, 100 Å, ઓર્ડર નંબર: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP ફ્લેશ કારતૂસ (ગોળાકાર સિલિકા, 20 - 45 μm, 100 Å, ઓર્ડર નંબર：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| તરંગલંબાઇ | 254 એનએમ | |||
| મોબાઇલ તબક્કો | દ્રાવક A: પાણી દ્રાવક B: મિથેનોલ | |||
| પ્રવાહ દર | 30 એમએલ/મિનિટ | |||
| નમૂના લોડ કરી રહ્યું છે | 300 મિલિગ્રામ (86% ની શુદ્ધતા સાથે બ્રિલિયન્ટ બ્લુ એફસીએફ) | |||
| ઢાળ | સમય (CV) | દ્રાવક B (%) | સમય (CV) | દ્રાવક B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
પરિણામો અને ચર્ચા
સેપાફ્લેશ C18AQ RP ફ્લેશ કારતૂસનો ઉપયોગ સેમ્પલ ડિસેલ્ટિંગ અને શુદ્ધિકરણ માટે કરવામાં આવ્યો હતો.સ્ટેપ ગ્રેડિયન્ટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો જેમાં શુદ્ધ પાણીનો ઉપયોગ મોબાઈલ તબક્કા તરીકે ઈલ્યુશનની શરૂઆતમાં કરવામાં આવ્યો હતો અને 10 કોલમ વોલ્યુમ્સ (CV) માટે ચાલતો હતો.આકૃતિ 3 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, મોબાઇલ તબક્કા તરીકે શુદ્ધ પાણીનો ઉપયોગ કરતી વખતે, નમૂના ફ્લેશ કારતૂસ પર સંપૂર્ણપણે જાળવી રાખવામાં આવ્યો હતો.આગળ, મોબાઇલ તબક્કામાં મિથેનોલ સીધો 100% સુધી વધારવામાં આવ્યો હતો અને 7.5 CV માટે ઢાળ જાળવવામાં આવ્યો હતો.નમૂના 11.5 થી 13.5 CV ની વચ્ચે બહાર કાઢવામાં આવ્યો હતો.એકત્રિત અપૂર્ણાંકોમાં, નમૂનાના દ્રાવણને NaH2PO4 બફર સોલ્યુશનમાંથી મિથેનોલમાં બદલવામાં આવ્યું હતું.અત્યંત જલીય દ્રાવણ સાથે સરખામણી કરતાં, પછીના પગલામાં રોટરી બાષ્પીભવન દ્વારા મિથેનોલને દૂર કરવું વધુ સરળ હતું, જે નીચેના સંશોધનને સરળ બનાવે છે.
આકૃતિ 3. C18AQ કારતૂસ પરના નમૂનાનો ફ્લેશ ક્રોમેટોગ્રામ.
મજબૂત ધ્રુવીયતાના નમૂનાઓ માટે C18AQ કારતૂસ અને નિયમિત C18 કારતૂસની રીટેન્શન વર્તણૂકની તુલના કરવા માટે, સમાંતર સરખામણી પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.SepaFlash C18 RP ફ્લેશ કારતૂસનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો અને નમૂના માટે ફ્લેશ ક્રોમેટોગ્રામ આકૃતિ 4 માં દર્શાવવામાં આવ્યું હતું. નિયમિત C18 કારતુસ માટે, સૌથી વધુ સહન કરેલ જલીય તબક્કાનું પ્રમાણ લગભગ 90% છે.તેથી શરૂઆતનો ઢાળ 90% પાણીમાં 10% મિથેનોલ પર સેટ કરવામાં આવ્યો હતો.આકૃતિ 4 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, ઉચ્ચ જલીય ગુણોત્તરને કારણે C18 સાંકળોના હાઇડ્રોફોબિક તબક્કાના ભંગાણને કારણે, નમૂના ભાગ્યે જ નિયમિત C18 કારતૂસ પર જાળવવામાં આવ્યા હતા અને મોબાઇલ તબક્કા દ્વારા સીધા જ બહાર કાઢવામાં આવ્યા હતા.પરિણામે, સેમ્પલ ડિસેલ્ટિંગ અથવા શુદ્ધિકરણની કામગીરી પૂર્ણ થઈ શકતી નથી.
આકૃતિ 4. નિયમિત C18 કારતૂસ પર નમૂનાનું ફ્લેશ ક્રોમેટોગ્રામ.
રેખીય ઢાળ સાથે સરખામણી કરતા, સ્ટેપ ગ્રેડિયન્ટના ઉપયોગના નીચેના ફાયદા છે:
1. સેમ્પલ શુદ્ધિકરણ માટે સોલવન્ટનો ઉપયોગ અને રન ટાઈમ ઘટાડવામાં આવે છે.
2. લક્ષિત ઉત્પાદન તીવ્ર શિખર પર બહાર આવે છે, જે એકત્રિત અપૂર્ણાંકનું પ્રમાણ ઘટાડે છે અને આમ નીચેના રોટરી બાષ્પીભવન તેમજ સમયની બચતની સુવિધા આપે છે.
3. એકત્ર કરેલ ઉત્પાદન મિથેનોલમાં હોય છે જેનું બાષ્પીભવન કરવું સરળ છે, આમ સૂકવવાનો સમય ઓછો થાય છે.
નિષ્કર્ષમાં, નમૂનાના શુદ્ધિકરણ માટે જે મજબૂત ધ્રુવીય અથવા ઉચ્ચ હાઇડ્રોફિલિક છે, SepaFlash C18AQ RP ફ્લેશ કારતુસ પ્રિપેરેટિવ ફ્લેશ ક્રોમેટોગ્રાફી સિસ્ટમ સાથે સંયોજન SepaBean™ મશીન ઝડપી અને કાર્યક્ષમ ઉકેલ પ્રદાન કરી શકે છે.
SepaFlash બોન્ડેડ સિરીઝ C18 RP ફ્લેશ કારતુસ વિશે
સેન્ટાઈ ટેક્નોલોજી (કોષ્ટક 2 માં બતાવ્યા પ્રમાણે) ના વિવિધ વિશિષ્ટતાઓ સાથે SepaFlash C18AQ RP ફ્લેશ કારતુસની શ્રેણી છે.
| આઇટમ નંબર | કૉલમનું કદ | પ્રવાહ દર (એમએલ/મિનિટ) | મહત્તમ દબાણ (psi/બાર) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 ગ્રામ | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 ગ્રામ | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 ગ્રામ | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 ગ્રામ | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 ગ્રામ | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 ગ્રામ | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 ગ્રામ | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 ગ્રામ | 40-80 | 250/17.2 |
કોષ્ટક 2. SepaFlash C18AQ RP ફ્લેશ કારતુસ.
પેકિંગ સામગ્રી: ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા ગોળાકાર C18(AQ)-બોન્ડેડ સિલિકા, 20 - 45 μm, 100 Å.
લોજી (કોષ્ટક 2 માં બતાવ્યા પ્રમાણે).
પોસ્ટ સમય: ઓગસ્ટ-27-2018