Hongcheng Wang, Bo Xu
Centro de I + D de aplicación
Introdución
Segundo as polaridades relativas da fase estacionaria e da fase móbil, a cromatografía líquida pódese dividir en cromatografía en fase normal (NPC) e cromatografía en fase revertida (RPC). Para RPC, a polaridade da fase móbil é máis forte que a da fase estacionaria. O RPC converteuse no máis empregado en modos de separación de cromatografía líquida debido á súa alta eficiencia, boa resolución e mecanismo de retención clara. Polo tanto, o RPC é adecuado para a separación e purificación de varios compostos polares ou non polares, incluíndo alcaloides, hidratos de carbono, ácidos graxos, esteroides, ácidos nucleicos, aminoácidos, péptidos, proteínas, etc. En RPC, incluíndo a fase estacionaria máis usada, c8, c4, c4, c4 Cyano, amino, etc. Entre estes grupos funcionais unidos, o máis usado é C18. Estímase que máis do 80% do RPC agora usa fase unida C18. Polo tanto, a columna de cromatografía C18 converteuse nunha columna universal imprescindible para cada laboratorio.
Aínda que a columna C18 pode usarse nunha gama moi ampla de aplicacións, con todo, para algunhas mostras que son moi polares ou altamente hidrófilas, as columnas C18 regulares poden ter problemas ao ser usados para purificar tales mostras. En RPC, os disolventes de elución de uso común pódense ordenar segundo a súa polaridade: auga <metanol <acetonitrilo <etanol <tetrahidrofurano <isopropanol. Para asegurar unha boa retención na columna para estas mostras (forte polar ou altamente hidrófilo), é necesaria unha alta proporción de sistema acuoso como fase móbil. Non obstante, ao usar o sistema de auga pura (incluída a auga pura ou a solución de sal puro) como fase móbil, a cadea de carbono longa na fase estacionaria da columna C18 tende a evitar a auga e a mesturar entre si, dando lugar a unha diminución instantánea da capacidade de retención da columna ou incluso sen retención. Este fenómeno chámase "colapso de fase hidrofóbica" (como se mostra na parte esquerda da figura 1). Aínda que esta situación é reversible cando se lava a columna con disolventes orgánicos como metanol ou acetonitrilo, aínda pode causar danos na columna. Polo tanto, é necesario evitar que se produza esta situación.
Figura 1. O diagrama esquemático das fases unidas na superficie do xel de sílice na columna C18 regular (esquerda) e columna C18AQ (dereita).
Para resolver os problemas mencionados anteriormente, os fabricantes de materiais de embalaxe cromatográficos fixeron melloras técnicas. Unha destas melloras é facer algunhas modificacións na superficie da matriz de sílice, como a introdución de grupos ciano hidrofílicos (como se mostra na parte dereita da figura 1), para facer máis hidrofílica a superficie do xel de sílice. Así, as cadeas C18 na superficie da sílice poderían estenderse completamente en condicións altamente acuosas e pódese evitar o colapso da fase hidrofóbica. Estas columnas modificadas C18 chámanse columnas acuosas C18, é dicir, columnas C18AQ, deseñadas para condicións de elución altamente acuosas e poden tolerar un sistema acuoso 100%. As columnas C18AQ aplicáronse amplamente na separación e purificación de compostos polares fortes, incluíndo ácidos orgánicos, péptidos, nucleósidos e vitaminas solubles en auga.
A desaltación é unha das aplicacións típicas de columnas C18AQ na purificación do flash para mostras, que elimina os compoñentes de sal ou tampón no disolvente da mostra para facilitar a aplicación da mostra en estudos posteriores. Neste post, a brillante FCF azul con forte polaridade foi usada como mostra e purificada na columna C18AQ. O disolvente da mostra foi substituído por disolvente orgánico da solución tampón, facilitando así a seguinte evaporación rotativa, así como aforrar disolventes e tempo de funcionamento. Ademais, a pureza da mostra mellorouse eliminando algunhas impurezas na mostra.
Sección experimental
Figura 2. A estrutura química da mostra.
O brillante FCF azul usouse como mostra nesta publicación. A pureza da mostra en bruto foi do 86% e a estrutura química da mostra mostrouse na figura 2. Para preparar a solución de mostra, disolveuse un sólido cru de 300 mg en po de brillante FCF azul brillante en solución de tampón NAH2PO4 de 1 M e sacudiu ben para converterse nunha solución completamente clara. A solución da mostra foi inxectada na columna Flash por un inxector. A configuración experimental da purificación do flash aparece na táboa 1.
| Instrumento | Máquina Sepabean ™2 | |||
| Cartuchos | 12 g Sepaflash C18 RP Cartucho flash (sílice esférica, 20-45 μm, 100 Å, número de orde: SW-5222-012-Sp) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Cartucho flash (sílice esférica, 20-45 μm, 100 Å, número de orde ： SW-5222-012-Sp (AQ)） | ||
| Lonxitude de onda | 254 nm | |||
| Fase móbil | Disolvente A ： Auga Disolvente B ： Metanol | |||
| Caudal | 30 ml/min | |||
| Carga de mostra | 300 mg (brillante FCF azul coa pureza do 86%) | |||
| Gradiente | Tempo (CV) | Disolvente B (%) | Tempo (CV) | Disolvente B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultados e discusión
Utilizouse un cartucho flash de sepaflash C18AQ RP para a desalentación e purificación da mostra. Utilizouse o gradiente de paso no que se usou auga pura como fase móbil no inicio da elución e funcionou por 10 volumes de columna (CV). Como se mostra na figura 3, ao usar auga pura como fase móbil, a mostra mantívose completamente no cartucho flash. A continuación, o metanol na fase móbil aumentouse directamente ata o 100% e o gradiente mantívose para 7,5 cv. A mostra eluíuse de 11,5 a 13,5 cv. Nas fraccións recollidas, a solución da mostra substituíuse da solución tampón NAH2PO4 ao metanol. Comparando con solución altamente acuosa, o metanol foi moito máis doado de ser eliminado por evaporación rotativa no paso posterior, o que facilita as seguintes investigacións.
Figura 3. O cromatograma flash da mostra nun cartucho C18AQ.
Para comparar o comportamento de retención do cartucho C18AQ e o cartucho C18 regular para mostras de forte polaridade, realizouse unha proba de comparación paralela. Na figura 4 mostrouse un cartucho flash de sepaflash C18 RP e o cromatograma flash para a mostra mostrouse na figura 4. Para os cartuchos regulares C18, a relación acuosa máis tolerada é aproximadamente o 90%. Polo tanto, o gradiente de inicio estableceuse nun 10% de metanol en 90% de auga. Como se mostra na figura 4, debido ao colapso da fase hidrofóbica das cadeas C18 causadas por alta relación acuosa, a mostra apenas se conservou no cartucho C18 regular e foi eluída directamente pola fase móbil. Como resultado, non se pode completar a operación de desalentación ou purificación da mostra.
Figura 4. O cromatograma flash da mostra nun cartucho C18 regular.
Comparando co gradiente lineal, o uso de gradiente de paso ten as seguintes vantaxes:
1. O uso de disolventes e o tempo de execución para a purificación da mostra redúcese.
2. O produto obxectivo eluta nun pico afiado, o que reduce o volume de fraccións recollidas e facilita así a seguinte evaporación rotativa así como aforrar tempo.
3. O produto recollido está en metanol que é fácil de evaporarse, polo que o tempo de secado redúcese.
En conclusión, para a purificación da mostra que é fortemente polar ou altamente hidrófila, os cartuchos de flash Sepaflash C18AQ RP que se combinan coa máquina do sistema de cromatografía flash preparativa podería ofrecer unha solución rápida e eficiente.
Sobre os cartuchos flash da serie C18 RP de sepaflash
Hai unha serie de cartuchos de flash Sepaflash C18AQ RP con diferentes especificacións da tecnoloxía Santai (como se mostra na táboa 2).
| Número de elemento | Tamaño da columna | Caudal (ml/min) | Max.pressura (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Táboa 2. Sepaflash C18AQ RP Cartuchos flash.
Materiais de embalaxe: sílice esférica de alta eficiencia C18 (aq) sílice, 20-45 μm, 100 Å.
Logy (como se mostra na táboa 2).
Tempo de publicación: agosto-27-2018