Hongcheng Wang, Bo Xu
Centro de I+D de aplicación
Introdución
Segundo as polaridades relativas da fase estacionaria e da fase móbil, a cromatografía líquida pódese dividir en cromatografía en fase normal (NPC) e cromatografía en fase inversa (RPC).Para RPC, a polaridade da fase móbil é máis forte que a da fase estacionaria.RPC converteuse no máis utilizado nos modos de separación por cromatografía líquida debido á súa alta eficiencia, boa resolución e mecanismo de retención claro.Polo tanto, RPC é axeitado para a separación e purificación de varios compostos polares ou non polares, incluíndo alcaloides, carbohidratos, ácidos graxos, esteroides, ácidos nucleicos, aminoácidos, péptidos, proteínas, etc. En RPC, a fase estacionaria máis utilizada é a matriz de xel de sílice que está unida a varios grupos funcionais, incluíndo C18, C8, C4, fenilo, ciano, amino, etc. Entre estes grupos funcionais unidos, o máis utilizado é o C18.Estímase que máis do 80% dos RPC están usando agora a fase de enlace C18.Polo tanto, a columna de cromatografía C18 converteuse nunha columna universal imprescindible para todos os laboratorios.
Aínda que a columna C18 pode usarse nunha ampla gama de aplicacións, con todo, para algunhas mostras que son moi polares ou moi hidrófilas, as columnas C18 normais poden ter problemas cando se usan para purificar tales mostras.En RPC, os disolventes de elución de uso habitual pódense ordenar segundo a súa polaridade: auga < metanol < acetonitrilo < etanol < tetrahidrofurano < isopropanol.Para asegurar unha boa retención na columna destas mostras (polares fortes ou moi hidrófilas), é necesario utilizar unha alta proporción de sistema acuoso como fase móbil.Non obstante, cando se usa un sistema de auga pura (incluíndo auga pura ou solución de sal pura) como fase móbil, a longa cadea de carbono na fase estacionaria da columna C18 tende a evitar a auga e mesturarse entre si, o que resulta nunha diminución instantánea do capacidade de retención da columna ou mesmo ningunha retención.Este fenómeno chámase "colapso de fase hidrofóbica" (como se mostra na parte esquerda da Figura 1).Aínda que esta situación é reversible cando a columna se lava con disolventes orgánicos como metanol ou acetonitrilo, aínda pode causar danos á columna.Polo tanto, é necesario evitar que se produza esta situación.
Figura 1. O diagrama esquemático das fases unidas na superficie do xel de sílice na columna normal C18 (esquerda) e columna C18AQ (dereita).
Para resolver os problemas mencionados anteriormente, os fabricantes de materiais de embalaxe cromatográficos realizaron melloras técnicas.Unha destas melloras é facer algunhas modificacións na superficie da matriz de sílice, como a introdución de grupos ciano hidrófilos (como se mostra na parte dereita da Figura 1), para facer a superficie do xel de sílice máis hidrófila.Deste xeito, as cadeas C18 na superficie da sílice poderían estenderse totalmente en condicións altamente acuosas e poderíase evitar o colapso da fase hidrófoba.Estas columnas C18 modificadas chámanse columnas C18 acuosas, é dicir, columnas C18AQ, que están deseñadas para condicións de elución altamente acuosas e poden tolerar un sistema acuoso ao 100%.As columnas C18AQ aplicáronse amplamente na separación e purificación de compostos polares fortes, incluíndo ácidos orgánicos, péptidos, nucleósidos e vitaminas solubles en auga.
A desalación é unha das aplicacións típicas das columnas C18AQ na purificación flash de mostras, que elimina o sal ou os compoñentes tampón no disolvente da mostra para facilitar a aplicación da mostra en estudos posteriores.Nesta publicación, utilizouse o Brilliant Blue FCF cunha forte polaridade como mostra e purificouse na columna C18AQ.O disolvente da mostra foi substituído por disolvente orgánico da solución tampón, facilitando así a seguinte evaporación rotatoria, así como aforrar disolventes e tempo de funcionamento.Ademais, mellorouse a pureza da mostra eliminando algunhas impurezas da mostra.
Sección Experimental
Figura 2. A estrutura química da mostra.
O Brilliant Blue FCF utilizouse como mostra nesta publicación.A pureza da mostra en bruto foi do 86 % e a estrutura química da mostra mostrouse na Figura 2. Para preparar a solución da mostra, disolvéronse 300 mg de sólido bruto en po de Brilliant Blue FCF nunha solución tampón de NaH2PO4 1 M e axitábanse ben para converterse unha solución completamente clara.A disolución da mostra foi entón inxectada na columna flash mediante un inxector.A configuración experimental da purificación flash está listada na Táboa 1.
| Instrumento | Máquina SepaBean™2 | |||
| Cartuchos | Cartucho flash SepaFlash C18 RP de 12 g (sílice esférica, 20 - 45 μm, 100 Å, número de pedido: SW-5222-012-SP) | Cartucho de flash SepaFlash C18AQ RP de 12 g (sílice esférica, 20 - 45 μm, 100 Å, número de pedido: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Lonxitude de onda | 254 nm | |||
| Fase móbil | Disolvente A: auga Disolvente B: metanol | |||
| Caudal | 30 ml/min | |||
| Carga da mostra | 300 mg (Azul Brillante FCF cunha pureza do 86%) | |||
| Degradado | Tempo (CV) | Disolvente B (%) | Tempo (CV) | Disolvente B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultados e discusión
Utilizouse un cartucho flash SepaFlash C18AQ RP para a dessalación e purificación da mostra.Utilizouse un gradiente de pasos no que se utilizou auga pura como fase móbil ao inicio da elución e funcionou para 10 volumes de columna (CV).Como se mostra na Figura 3, cando se usa auga pura como fase móbil, a mostra retívose completamente no cartucho flash.A continuación, o metanol na fase móbil aumentouse directamente ata o 100% e mantívose o gradiente durante 7,5 CV.A mostra eluíuse de 11,5 a 13,5 CV.Nas fraccións recollidas, a solución da mostra foi substituída da solución tampón de NaH2PO4 por metanol.En comparación coa solución altamente acuosa, o metanol foi moito máis fácil de eliminar mediante evaporación rotatoria no paso posterior, o que facilita a seguinte investigación.
Figura 3. O cromatograma flash da mostra nun cartucho C18AQ.
Para comparar o comportamento de retención do cartucho C18AQ e do cartucho C18 normal para mostras de forte polaridade, realizouse unha proba de comparación paralela.Utilizouse un cartucho flash SepaFlash C18 RP e o cromatograma flash para a mostra mostrouse na Figura 4. Para cartuchos C18 normais, a relación de fase acuosa tolerada máis alta é de aproximadamente o 90 %.Polo tanto, o gradiente de inicio estableceuse nun 10% de metanol nun 90% de auga.Como se mostra na Figura 4, debido ao colapso da fase hidrófoba das cadeas C18 causado pola alta proporción acuosa, a mostra apenas se retivo no cartucho C18 normal e foi eluída directamente pola fase móbil.Como resultado, non se pode completar a operación de desalado ou purificación da mostra.
Figura 4. O cromatograma flash da mostra nun cartucho C18 normal.
Comparando co gradiente lineal, o uso do gradiente por pasos ten as seguintes vantaxes:
1. Redúcese o uso de disolventes e o tempo de execución para a purificación da mostra.
2. O produto obxectivo elúese nun pico agudo, o que reduce o volume das fraccións recollidas e facilita así a seguinte evaporación rotatoria ademais de aforrar tempo.
3. O produto recollido está en metanol que é fácil de evaporar, polo que se reduce o tempo de secado.
En conclusión, para a purificación da mostra que é fortemente polar ou altamente hidrófila, os cartuchos flash SepaFlash C18AQ RP que se combinan co sistema de cromatografía flash preparativa SepaBean™ Machine poderían ofrecer unha solución rápida e eficiente.
Acerca dos cartuchos flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Hai unha serie de cartuchos de flash SepaFlash C18AQ RP con diferentes especificacións de Santai Technology (como se mostra na táboa 2).
| Número de elemento | Tamaño da columna | Caudal (ml/min) | Presión máx (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Táboa 2. Cartuchos flash SepaFlash C18AQ RP.
Materiais de embalaxe: sílice unida a C18(AQ) esférica de alta eficiencia, 20 - 45 μm, 100 Å.
lóxica (como se mostra na táboa 2).
Hora de publicación: 27-Ago-2018