Rui Huang, Bo Xu
Applikaasje R&D Sintrum
Ynlieding
In peptide is in ferbining gearstald út aminosoeren, dy't elk unike fysike en gemyske eigenskippen hawwe fanwegen de ferskillende soarten en folchoarder fan aminosoeren dy't har folchoarder foarmje.Mei de ûntwikkeling fan gemyske synteze fan fêste faze hat de gemyske synteze fan ferskate aktive peptiden grutte foarútgong makke.Troch de komplisearre gearstalling fan it peptide krigen troch fêste fazesynteze moat it definitive produkt lykwols wurde suvere troch betroubere skiedingsmetoaden.De meast brûkte suveringsmetoaden foar peptiden omfetsje ion-útwikselingchromatografy (IEC) en omkearde-fase hege prestaasjes floeistofchromatografy (RP-HPLC), dy't de neidielen hawwe fan lege sample-laadkapasiteit, hege kosten fan skiedingsmedia, yngewikkelde en djoere skiedingsapparatuer, Foar de rappe suvering fan peptiden fan lytse molekulen (MW < 1 kDa), waard earder in suksesfolle oanfraachgefal publisearre troch Santai Technologies, wêryn in SepaFlash RP C18-cartridge brûkt waard foar de rappe suvering fan thymopentine (TP-5) en de doelprodukt dat foldocht oan de easken waard krigen.
figuer 1. 20 mienskiplike aminosoeren (werjûn út www.bachem.com).
D'r binne 20 soarten aminosoeren dy't mienskiplik binne yn 'e gearstalling fan peptiden.Dizze aminosoeren kinne wurde ferdield yn 'e folgjende groepen neffens har polariteit en soere-base-eigenskip: net-polêr (hydrofoob), polêr (ûnladen), soer as basis (lykas werjûn yn figuer 1).Yn in peptidesekwinsje, as de aminosoeren dy't de folchoarder foarmje meast poal binne (lykas oanjûn yn roze kleur yn figuer 1), lykas Cysteine, Glutamine, Asparagine, Serine, Threonine, Tyrosine, ensfh., dan kin dit peptide in sterke polariteit en wêze heechoplosber yn wetter.Tidens de suveringsproseduere foar dizze sterke polêre peptidemonsters troch omkearde-fase-chromatografy, sil in ferskynsel foarkomme neamd hydrofobe faze-ynstoarten (ferwize nei in earder publisearre applikaasjenota troch Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns en harren applikaasjes).Yn ferliking mei de reguliere C18 kolommen, de ferbettere C18AQ kolommen binne meast geskikt foar de suvering fan sterke polar of hydrophilic gebrûk.Yn dizze post waard in sterk poal peptide brûkt as it stekproef en suvere troch in C18AQ kolom.As resultaat waard it doelprodukt dat oan 'e easken foldocht krigen en koe wurde brûkt yn it folgjende ûndersyk en ûntwikkeling.
| Ynstrumint | SepaBean™masine 2 | |||
| Cartridges | 12 g SepaFlash C18 RP flash cartridge (sferysk silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestelling nûmer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash cartridge (sferysk silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestelnûmer: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Golflingte | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobile faze | Oplosmiddel A: wetter Oplosmiddel B: Acetonitrile | |||
| Flow rate | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Sample laden | 30 mg | |||
| Gradient | Tiid (CV) | Oplosmiddel B (%) | Tiid (min) | Oplosmiddel B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Resultaten en diskusje
Om de suveringsprestaasjes te fergelykjen foar it polêre peptidemonster tusken gewoane C18-kolom en C18AQ-kolom, brûkten wy in gewoane C18-kolom foar de flitsreiniging fan 'e stekproef as in begjin.Lykas werjûn yn figuer 2, fanwege de hydrofobe faze ynstoarten fan 'e C18 keatlingen feroarsake troch hege aqueous ratio, de stekproef waard amper bewarre op de reguliere C18 cartridge en waard direkt eluted út troch de mobile faze.As gefolch waard it stekproef net effektyf skieden en suvere.
figuer 2. De flash chromatogram fan de stekproef op in gewoane C18 cartridge.
Dêrnei brûkten wy in C18AQ-kolom foar de flitsreiniging fan it stekproef.Lykas werjûn yn figuer 3, waard it peptide effektyf bewarre bleaun op 'e kolom en dan útlutsen.It doelprodukt waard skieden fan 'e ûnreinheden yn' e rauwe stekproef en sammele.Nei lyophilization en dan analysearre troch HPLC, it suvere produkt hat in suverens fan 98,2% en koe fierder brûkt wurde foar folgjende stap ûndersyk en ûntwikkeling.
figuer 3. De flash chromatogram fan de stekproef op in C18AQ cartridge.
Ta beslút, SepaFlash C18AQ RP flash cartridge kombinearre mei it flash chromatography systeem SepaBean™masine koe biede in flugge en effektive oplossing foar de suvering fan sterke polar of hydrophilic gebrûk.
Der binne in rige fan de SepaFlash C18AQ RP flash cartridges mei ferskillende spesifikaasjes fan Santai Technology (lykas werjûn yn Tabel 2).
| Item nûmer | Kolom Grutte | Flow Rate (ml/min) | Max. Druk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
tabel 2. SepaFlash C18AQ RP flash cartridges.Ferpakkingsmateriaal: Hege effisjinsje sfearysk C18(AQ)-bûn silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
Foar fierdere ynformaasje oer detaillearre spesifikaasjes fan SepaBean ™ masine, of de oarder ynformaasje oer SepaFlash rige flash cartridges, besykje ús webside.
Post tiid: okt-12-2018