Hongcheng Wang, Bo Xu
Centre de R&D d'application
Introduction
Selon les polarités relatives de la phase stationnaire et de la phase mobile, la chromatographie liquide peut être divisée en chromatographie de phase normale (NPC) et chromatographie en phase inversée (RPC). Pour RPC, la polarité de la phase mobile est plus forte que celle de la phase stationnaire. Le RPC est devenu le plus largement utilisé dans les modes de séparation de chromatographie liquide en raison de sa grande efficacité, de sa bonne résolution et de son mécanisme de rétention claire. Par conséquent, RPC convient par la séparation et la purification de divers composés polaires ou non polaires, y compris les alcaloïdes, les glucides, les acides gras, les stéroïdes, Cyano, amino, etc. Parmi ces groupes fonctionnels liés, le plus largement utilisé est C18. On estime que plus de 80% du RPC utilise désormais une phase liée à C18. Par conséquent, la colonne de chromatographie C18 est devenue une colonne universelle incontournable pour chaque laboratoire.
Bien que la colonne C18 puisse être utilisée dans une très large gamme d'applications, cependant, pour certains échantillons qui sont très polaires ou hautement hydrophiles, les colonnes C18 régulières peuvent avoir des problèmes lorsqu'ils sont utilisés pour purifier ces échantillons. Dans RPC, les solvants d'élution couramment utilisés peuvent être commandés en fonction de leur polarité: eau <méthanol <acétonitrile <éthanol <tétrahydrofuran <isopropanol. Pour assurer une bonne rétention sur la colonne pour ces échantillons (solide polaire ou hautement hydrophile), une proportion élevée de système aqueux est nécessaire pour être utilisée comme phase mobile. Cependant, lors de l'utilisation du système d'eau pure (y compris de l'eau pure ou une solution saline pure) comme phase mobile, la longue chaîne de carbone sur la phase stationnaire de la colonne C18 a tendance à éviter l'eau et à se mélanger entre elles, entraînant une diminution instantanée de la capacité de rétention de la colonne ou même pas de rétention. Ce phénomène est appelé «effondrement de la phase hydrophobe» (comme indiqué dans la partie gauche de la figure 1). Bien que cette situation soit réversible lorsque la colonne est lavée avec des solvants organiques tels que le méthanol ou l'acétonitrile, il peut encore endommager la colonne. Par conséquent, il est nécessaire d'empêcher cette situation de se produire.
Figure 1. Le diagramme schématique des phases liées à la surface du gel de silice dans la colonne C18 ordinaire (à gauche) et la colonne C18AQ (à droite).
Pour résoudre les problèmes mentionnés ci-dessus, les fabricants de matériaux d'emballage chromatographique ont apporté des améliorations techniques. L'une de ces améliorations consiste à apporter des modifications à la surface de la matrice de silice, telles que l'introduction de groupes cyano hydrophiles (comme le montre la bonne partie de la figure 1), pour rendre la surface du gel de silice plus hydrophile. Ainsi, les chaînes C18 sur la surface de la silice pourraient être entièrement étendues dans des conditions hautement aqueuses et l'effondrement de la phase hydrophobe pourrait être évité. Ces colonnes C18 modifiées sont appelées colonnes aqueuses C18, à savoir les colonnes C18AQ, qui sont conçues pour des conditions d'élution hautement aqueuses et peuvent tolérer le système 100% aqueux. Les colonnes C18AQ ont été largement appliquées dans la séparation et la purification de forts composés polaires, y compris les acides organiques, les peptides, les nucléosides et les vitamines solubles dans l'eau.
Le dessalement est l'une des applications typiques des colonnes C18AQ dans la purification du flash pour les échantillons, qui élimine les composants de sel ou de tampon dans le solvant de l'échantillon pour faciliter l'application de l'échantillon dans les études ultérieures. Dans cet article, le FCF bleu brillant avec une forte polarité a été utilisé comme échantillon et purifié sur la colonne C18AQ. Le solvant d'échantillon a été remplacé par le solvant organique à partir de la solution tampon, facilitant ainsi l'évaporation rotative suivante ainsi que la sauvegarde des solvants et le temps de fonctionnement. De plus, la pureté de l'échantillon a été améliorée en éliminant certaines impuretés dans l'échantillon.
Section expérimentale
Figure 2. La structure chimique de l'échantillon.
Le FCF bleu brillant a été utilisé comme échantillon dans ce post. La pureté de l'échantillon brut était de 86% et la structure chimique de l'échantillon a été représentée sur la figure 2. Pour préparer la solution d'échantillon, 300 mg de brut poudreux solide de FCF bleu brillant a été dissous dans une solution de tampon NAH2PO4 1 m et bien secoué pour devenir une solution complètement claire. La solution d'échantillon a ensuite été injectée dans la colonne Flash par un injecteur. La configuration expérimentale de la purification du flash est répertoriée dans le tableau 1.
| Instrument | Machine Sepaean ™2 | |||
| Cartouches | 12 g Sépaflash C18 RP Cartouche flash (silice sphérique, 20 - 45 μm, 100 Å, numéro de commande: SW-5222-012-SP) | 12 g Sépaflash C18AQ RP CARTRIDGE FLASH (silice sphérique, 20 - 45 μm, 100 Å, numéro de commande: SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Longueur d'onde | 254 nm | |||
| Phase mobile | Solvant un ： eau Solvant B ： Methanol | |||
| Débit | 30 ml / min | |||
| Chargement des échantillons | 300 mg (FCF bleu brillant avec une pureté de 86%) | |||
| Pente | Temps (CV) | Solvant B (%) | Temps (CV) | Solvant B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Résultats et discussion
Une cartouche flash SEPAFLASH C18AQ RP a été utilisée pour le dessalement et la purification des échantillons. Le gradient de pas a été utilisé dans lequel l'eau pure a été utilisée comme phase mobile au début de l'élution et exécutée pour 10 volumes de colonnes (CV). Comme le montre la figure 3, lors de l'utilisation de l'eau pure comme phase mobile, l'échantillon a été complètement conservé sur la cartouche flash. Ensuite, le méthanol en phase mobile a été directement augmenté à 100% et le gradient a été maintenu pour 7,5 cv. L'échantillon a été élue de 11,5 à 13,5 cv. Dans les fractions collectées, la solution d'échantillon a été remplacée par la solution tampon NAH2PO4 au méthanol. En comparaison avec une solution hautement aqueuse, le méthanol était beaucoup plus facile à éliminer par évaporation rotative à l'étape suivante, ce qui facilite les recherches suivantes.
Figure 3. Le chromatogramme flash de l'échantillon sur une cartouche C18AQ.
Pour comparer le comportement de rétention de la cartouche C18AQ et de la cartouche C18 ordinaire pour des échantillons de polarité forte, un test de comparaison parallèle a été effectué. Une cartouche flash SEPAFLASH C18 RP a été utilisée et le chromatogramme flash pour l'échantillon a été illustré à la figure 4. Pour les cartouches C18 régulières, le rapport de phase aqueux toléré le plus élevé est d'environ 90%. Par conséquent, le gradient de début a été fixé à 10% de méthanol dans 90% d'eau. Comme le montre la figure 4, en raison de l'effondrement de la phase hydrophobe des chaînes C18 causées par un rapport aqueux élevé, l'échantillon a été à peine conservé sur la cartouche C18 ordinaire et a été directement élue par la phase mobile. En conséquence, le fonctionnement du dessalement ou de la purification des échantillons ne peut pas être terminé.
Figure 4. Le chromatogramme flash de l'échantillon sur une cartouche C18 ordinaire.
En comparaison avec le gradient linéaire, l'utilisation du gradient de pas a les avantages suivants:
1. L'utilisation du solvant et le temps d'exécution pour la purification des échantillons sont réduites.
2. Le produit cible s'échappe dans un pic net, ce qui réduit le volume des fractions collectées et facilite ainsi l'évaporation rotative suivante ainsi que du temps d'économie.
3. Le produit collecté est dans le méthanol qui est facile à évaporer, donc le temps de séchage est réduit.
En conclusion, pour la purification de l'échantillon qui est fortement polaire ou hautement hydrophile, les cartouches flash SEPAFLASH C18AQ RP se combinant avec le système de chromatographie flash préparatif Sepaean ™ Machine pourrait offrir une solution rapide et efficace.
À propos de la série de cartouches flash C18 RP liée à la sépaflash
Il existe une série de cartouches flash SEPAFLASH C18AQ RP avec différentes spécifications de la technologie Santai (comme le montre le tableau 2).
| Numéro d'article | Taille de la colonne | Débit (ml / min) | Pression maximale (Psi / bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5,4 g | 5-15 | 400 / 27,5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400 / 27,5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400 / 27,5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400 / 27,5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350 / 24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300 / 20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300 / 20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250 / 17.2 |
Tableau 2. SEPAFLASH C18AQ RP CARTRIDGES FLASH.
Matériaux d'emballage: silice sphérique à haute efficacité C18 (aq), 20 - 45 μm, 100 Å.
Logy (comme indiqué dans le tableau 2).
Heure du poste: août-27-2018