Mingzu Yang, Bo Xu
Sovelluksen T&K-keskus
Johdanto
Antibiootit ovat luokka sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita, joita tuottavat mikro-organismit (mukaan lukien bakteerit, sienet, aktinomykeetit) tai vastaavat yhdisteet, jotka syntetisoidaan kemiallisesti tai puolisyntetisoituina.Antibiootit voivat estää muiden mikro-organismien kasvua ja selviytymistä.Ensimmäisen ihmisen löytämän antibiootin, penisilliinin, löysi brittiläinen mikrobiologi Alexander Fleming vuonna 1928. Hän havaitsi, että homeen läheisyydessä olevat bakteerit eivät voineet kasvaa stafylokokkiviljelymaljassa, joka oli homeen saastuttama.Hän oletti, että homeen täytyy erittää antibakteerista ainetta, jonka hän nimesi vuonna 1928 penisilliiniksi. Vaikuttavia aineita ei kuitenkaan tuolloin puhdistettu.Vuonna 1939 Ernst Chain ja Howard Florey Oxfordin yliopistosta päättivät kehittää lääkkeen, joka voisi hoitaa bakteeri-infektioita.Otettuaan yhteyttä Flemingiin saadakseen kantoja, he uuttivat ja puhdistivat penisilliiniä kannoista onnistuneesti.Penisilliinin menestyksekkäästä kehittämisestä terapeuttisena lääkkeenä Fleming, Chain ja Florey jakoivat vuoden 1945 lääketieteen Nobelin.
Antibiootteja käytetään antibakteerisina aineina bakteeri-infektioiden hoitoon tai ehkäisyyn.Antibakteerisina aineina käytetään useita pääkategorioita antibiooteista: β-laktaamiantibiootit (mukaan lukien penisilliini, kefalosporiinit jne.), aminoglykosidiantibiootit, makrolidiantibiootit, tetrasykliiniantibiootit, kloramfenikoli (kokonaissynteettinen antibiootti) jne. Antibioottien lähteitä ovat mm. biologinen käyminen, puolisynteesi ja kokonaissynteesi.Biologisella fermentaatiolla tuotettuja antibiootteja on muutettava rakenteellisesti kemiallisin menetelmin kemiallisen stabiilisuuden, myrkyllisten sivuvaikutusten, antibakteerisen kirjon ja muiden ongelmien vuoksi.Kemiallisesti modifioinnin jälkeen antibiootit saattoivat saavuttaa parantuneen stabiilisuuden, vähentyneen toksisten sivuvaikutusten, laajentuneen antibakteerisen spektrin, alentuneen lääkeresistenssin, parantuneen biologisen hyötyosuuden ja siten parantuneen lääkehoidon vaikutuksen.Siksi puolisynteettiset antibiootit ovat tällä hetkellä suosituin suunta antibioottisten lääkkeiden kehittämisessä.
Puolisynteettisten antibioottien kehittämisessä antibiooteilla on alhaisen puhtauden, paljon sivutuotteita ja monimutkaisia komponentteja ominaisuuksia, koska ne ovat peräisin mikrobien fermentaatiotuotteista.Tässä tapauksessa puolisynteettisten antibioottien epäpuhtauksien analysointi ja valvonta on erityisen tärkeää.Epäpuhtauksien tunnistamiseksi ja karakterisoimiseksi tehokkaasti on tarpeen saada riittävä määrä epäpuhtauksia puolisynteettisten antibioottien synteettisestä tuotteesta.Yleisesti käytettyjen epäpuhtauksien valmistustekniikoiden joukossa flash-kromatografia on kustannustehokas menetelmä, jonka etuja ovat esimerkiksi suuri näytteiden latausmäärä, alhainen hinta, ajansäästö jne. Synteettiset tutkijat ovat käyttäneet flash-kromatografiaa yhä enemmän.
Tässä viestissä puolisynteettisen aminoglykosidiantibiootin pääepäpuhtautta käytettiin näytteenä ja puhdistettiin SepaFlash C18AQ -patruunalla yhdistettynä flash-kromatografiajärjestelmään SepaBean™-koneeseen.Vaatimukset täyttävä kohdetuote saatiin onnistuneesti, mikä viittaa erittäin tehokkaaseen ratkaisuun näiden yhdisteiden puhdistamiseen.
Kokeellinen osa
Näytteen toimitti ystävällisesti paikallinen lääkeyhtiö.Näyte oli eräänlaista aminopolysyklistä hiilihydraattia ja sen molekyylirakenne oli samanlainen kuin aminoglykosidiantibioottien.Näytteen polariteetti oli melko korkea, mikä teki siitä hyvin vesiliukoisen.Kaavakuva näytteen molekyylirakenteesta on esitetty kuvassa 1. Raakanäytteen puhtaus oli noin 88 % HPLC:llä analysoituna.Näiden erittäin polaaristen yhdisteiden puhdistamiseksi näyte pysyisi tuskin tavallisissa C18-kolonneissa aikaisempien kokemustemme mukaan.Siksi näytteen puhdistukseen käytettiin C18AQ-kolonnia.
Kuva 1. Kaavakuva näytteen molekyylirakenteesta.
Näyteliuoksen valmistamiseksi 50 mg raakanäytettä liuotettiin 5 ml:aan puhdasta vettä ja ultraäänikäsiteltiin, jotta siitä tuli täysin kirkas liuos.Näyteliuos injektoitiin sitten flash-kolonniin injektorilla.Flash-puhdistuksen kokeellinen järjestely on lueteltu taulukossa 1.
| Instrumentti | SepaBean™ kone 2 | |
| Kasetit | 12 g SepaFlash C18AQ RP -salamapatruuna (pallomainen piidioksidi, 20 - 45 μm, 100 Å, tilausnumero: SW-5222-012-SP(AQ)) | |
| Aallonpituus | 204 nm, 220 nm | |
| Liikkuva vaihe | Liuotin A: Vesi Liuotin B: asetonitriili | |
| Virtausnopeus | 15 ml/min | |
| Näytteen lataus | 50 mg | |
| Kaltevuus | Aika (min) | Liuotin B (%) |
| 0 | 0 | |
| 19.0 | 8 | |
| 47,0 | 80 | |
| 52,0 | 80 | |
Tulokset ja keskustelu
C18AQ-patruunan näytteen flash-kromatogrammi esitettiin kuvassa 2. Kuten kuvassa 2 esitetään, erittäin polaarinen näyte pysyi tehokkaasti C18AQ-patruunassa.Kerättyjen fraktioiden lyofolisoinnin jälkeen kohdetuotteen puhtaus oli 96,2 % (kuten esitetään kuviossa 3) HPLC-analyysin perusteella.Tulokset osoittivat, että puhdistettua tuotetta voitaisiin hyödyntää edelleen seuraavassa tutkimus- ja kehitysvaiheessa.
Kuva 2. C18AQ-patruunan näytteen flash-kromatogrammi.
Kuva 3. Kohdetuotteen HPLC-kromatogrammi.
Yhteenvetona voidaan todeta, että SepaFlash C18AQ RP flash-patruuna yhdistettynä flash-kromatografiajärjestelmään SepaBean™-koneeseen voisi tarjota nopean ja tehokkaan ratkaisun erittäin polaaristen näytteiden puhdistamiseen.
Tietoja SepaFlash C18AQ RP -salamapatruunoista
Santai Technologylta on saatavilla useita SepaFlash C18AQ RP -salamakasetteja, joilla on erilaiset tekniset tiedot (ks. taulukko 2).
| Tuotenumero | Sarakkeen koko | Virtausnopeus (ml/min) | Max.paine (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Taulukko 2. SepaFlash C18AQ RP -salamakasetit.Pakkausmateriaalit: Tehokas pallomainen C18(AQ)-sidottu piidioksidi, 20 - 45 μm, 100 Å.
Lisätietoja SepaBean™-koneen yksityiskohtaisista teknisistä tiedoista tai SepaFlash-sarjan salamapatruunoiden tilaustietoja on verkkosivuillamme.
Postitusaika: 26.10.2018