Rui Huang, Bo Xu
Sovelluksen T&K-keskus
Johdanto
Peptidi on yhdiste, joka koostuu aminohapoista, joilla jokaisella on ainutlaatuiset fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet johtuen sen sekvenssin muodostavien aminohappotähteiden eri tyypeistä ja järjestyksestä.Kiinteän faasin kemiallisen synteesin kehittymisen myötä eri aktiivisten peptidien kemiallinen synteesi on edistynyt suuresti.Kuitenkin kiinteäfaasisynteesillä saadun peptidin monimutkaisen koostumuksen vuoksi lopputuote tulisi puhdistaa luotettavilla erotusmenetelmillä.Peptidien yleisesti käytettyjä puhdistusmenetelmiä ovat ioninvaihtokromatografia (IEC) ja käänteisfaasinen korkean suorituskyvyn nestekromatografia (RP-HPLC), joiden haittapuolena on alhainen näytteenottokapasiteetti, korkeat erotusväliaineiden kustannukset, monimutkainen ja kallis erotuslaitteisto, jne. Pienmolekyylisten peptidien (MW < 1 kDa) nopeaa puhdistamista varten Santai Technologies julkaisi aiemmin onnistuneen sovellustapauksen, jossa SepaFlash RP C18 -patruunaa käytettiin tymopentiinin (TP-5) nopeaan puhdistukseen ja vaatimukset täyttävä kohdetuote saatiin.
Kuva 1. 20 yleistä aminohappoa (toistettu osoitteesta www.bachem.com).
On olemassa 20 erilaista aminohappoa, jotka ovat yleisiä peptidien koostumuksessa.Nämä aminohapot voidaan jakaa seuraaviin ryhmiin niiden polaarisuuden ja happo-emäsominaisuuden mukaan: ei-polaarinen (hydrofobinen), polaarinen (varautumaton), hapan tai emäksinen (kuten kuvassa 1 on esitetty).Jos peptidisekvenssissä sekvenssin muodostavat aminohapot ovat enimmäkseen polaarisia (kuten merkitty vaaleanpunaisella värillä kuvassa 1), kuten kysteiini, glutamiini, asparagiini, seriini, treoniini, tyrosiini jne., tällä peptidillä voi olla vahva polariteetti ja liukenevat hyvin veteen.Näiden vahvojen polaaristen peptidinäytteiden puhdistamisen aikana käänteisfaasikromatografialla tapahtuu ilmiö, jota kutsutaan hydrofobisen faasin romahtamiseen (katso Santai Technologiesin aiemmin julkaisema sovellushuomautus: Hydrofobinen vaiheen romahdus, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).Tavallisiin C18-kolonniin verrattuna parannetut C18AQ-kolonnit soveltuvat parhaiten vahvojen polaaristen tai hydrofiilisten näytteiden puhdistukseen.Tässä viestissä vahvaa polaarista peptidiä käytettiin näytteenä ja puhdistettiin C18AQ-pylväällä.Tuloksena saatiin vaatimukset täyttävä kohdetuote, jota voitiin käyttää seuraavassa tutkimus- ja kehitystyössä.
| Instrumentti | SepaBean™kone 2 | |||
| Kasetit | 12 g SepaFlash C18 RP -salamapatruuna (pallomainen piidioksidi, 20 - 45 μm, 100 Å, tilausnumero: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP -salamapatruuna (pallomainen piidioksidi, 20 - 45 μm, 100 Å, tilausnumero: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Aallonpituus | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Liikkuva vaihe | Liuotin A: Vesi Liuotin B: asetonitriili | |||
| Virtausnopeus | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Näytteen lataus | 30 mg | |||
| Kaltevuus | Aika (CV) | Liuotin B (%) | Aika (min) | Liuotin B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Tulokset ja keskustelu
Polaarisen peptidinäytteen puhdistustehokkuuden vertaamiseksi tavallisen C18-kolonnin ja C18AQ-kolonnin välillä käytimme tavallista C18-kolonnia näytteen flash-puhdistukseen aloituksena.Kuten kuviossa 2 esitetään, suuren vesisuhteen aiheuttaman C18-ketjujen hydrofobisen faasin romahtamisen vuoksi näyte pysyi tuskin tavallisessa C18-patruunassa ja eluoitui suoraan ulos liikkuvasta faasista.Tämän seurauksena näytettä ei erotettu ja puhdistettu tehokkaasti.
Kuva 2. Tavallisen C18-patruunan näytteen flash-kromatogrammi.
Seuraavaksi käytimme C18AQ-kolonnia näytteen flash-puhdistukseen.Kuten kuviossa 3 esitetään, peptidi pysyi tehokkaasti pylväässä ja eluoitui sitten ulos.Kohdetuote erotettiin raakanäytteen epäpuhtauksista ja kerättiin.Lyofilisoinnin ja sitten HPLC-analyysin jälkeen puhdistetun tuotteen puhtaus on 98,2 % ja sitä voitaisiin edelleen käyttää seuraavan vaiheen tutkimukseen ja kehittämiseen.
Kuva 3. C18AQ-patruunan näytteen flash-kromatogrammi.
Lopuksi, SepaFlash C18AQ RP -flash-patruuna yhdistettynä flash-kromatografiajärjestelmään SepaBean™kone voisi tarjota nopean ja tehokkaan ratkaisun vahvojen polaaristen tai hydrofiilisten näytteiden puhdistamiseen.
Santai Technologylta on saatavilla useita SepaFlash C18AQ RP -salamakasetteja, joilla on erilaiset tekniset tiedot (ks. taulukko 2).
| Tuotenumero | Sarakkeen koko | Virtausnopeus (ml/min) | Max.paine (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Taulukko 2. SepaFlash C18AQ RP -salamakasetit.Pakkausmateriaalit: Tehokas pallomainen C18(AQ)-sidottu piidioksidi, 20 - 45 μm, 100 Å.
Lisätietoja SepaBean™-koneen yksityiskohtaisista teknisistä tiedoista tai SepaFlash-sarjan salamapatruunoiden tilaustietoja on verkkosivuillamme.
Postitusaika: 12.10.2018