Hongcheng Wang, bo xu
Sovellus- ja kehityskeskus
Esittely
Kiinteän faasin ja liikkuva faasin suhteellisten polaarisuuksien mukaan nestekromatografia voidaan jakaa normaaliin faasikromatografiaan (NPC) ja käänteiseen faasikromatografiaan (RPC). RPC: lle liikkuvan vaiheen napaisuus on vahvempi kuin kiinteän vaiheen. RPC: stä on tullut eniten käytetty nestekromatografian erotusmoodissa sen korkean hyötysuhteen, hyvän resoluution ja selkeän retentiomekanismin vuoksi. Siksi RPC soveltuu erilaisten polaaristen tai ei-polaaristen yhdisteiden, mukaan lukien alkaloidit, hiilihydraatit, rasvahapot, steroidit, nukleiinihapot, aminohapot, peptidit, proteiinit jne., Eroon ja puhdistamiseen RPC: ssä, yleisimmin käytettyjen kiinteiden faasien IS-silikageeli-matriisin kanssa. Syano, amino jne. Näiden sitoutuneiden funktionaalisten ryhmien joukossa on eniten käytetty C18. Arvioidaan, että yli 80% RPC: stä käyttää nyt C18 -sidosvaihetta. Siksi C18-kromatografiapylväästä on tullut välttämätön universaali sarake jokaiselle laboratoriolle.
Vaikka C18 -pylväästä voidaan käyttää erittäin laajassa sovellusvalikoimassa, joillekin näytteille, jotka ovat erittäin polaarisia tai erittäin hydrofiilisiä, tavallisilla C18 -pylväillä voi olla ongelmia, kun niitä käytetään tällaisten näytteiden puhdistamiseen. RPC: ssä yleisesti käytetyt eluutioliuottimet voidaan tilata niiden napaisuuden mukaan: vesi <metanoli <asetonitriili <etanoli <tetrahydrofuraani <isopropanoli. Näiden näytteiden (voimakas polaarinen tai erittäin hydrofiilinen) pylvään hyvä retentio varmistaakseen suurta osaa vesipitoisesta järjestelmästä on välttämätöntä käyttää liikkuvana faasina. Kun käytät puhdasta vesijärjestelmää (mukaan lukien puhdas vesi tai puhdas suolaliuos) liikkuvana faasina, C18 -pylvään paikallaan olevassa vaiheessa oleva pitkä hiiliketju pyrkii kuitenkin välttämään vettä ja sekoittumaan toistensa kanssa, mikä johtaa pylvään retentiokykyyn hetkelliseen vähentymiseen tai edes pidättämiseen. Tätä ilmiötä kutsutaan ”hydrofobiseksi faasin romahtamiseksi” (kuten kuvan 1 vasemmassa osassa esitetään). Vaikka tämä tilanne on palautuva, kun pylväs pestään orgaanisilla liuottimilla, kuten metanolilla tai asetonitriilillä, se voi silti aiheuttaa pylvään vaurioita. Siksi on välttämätöntä estää tilannetta.
Kuvio 1. Sidosfaasien kaavio piidioelin pinnalla tavanomaisessa C18 -pylväässä (vasen) ja C18AQ -sarakkeessa (oikea).
Edellä mainittujen ongelmien ratkaisemiseksi kromatografiset pakkausmateriaalien valmistajat ovat tehneet teknisiä parannuksia. Yksi näistä parannuksista on tehdä joitain modifikaatioita piidioksidimatriisin pinnalle, kuten hydrofiilisten syaaniryhmien käyttöönotto (kuten kuvion 1 oikeassa osassa esitetään), jotta piidiohan geelin pinta olisi hydrofiilisempi. Siten piidioksidin pinnan C18 -ketjuja voitaisiin laajentaa täysin erittäin vesipitoisissa olosuhteissa ja hydrofobista faasin romahtamista voitiin välttää. Näitä modifioituja C18 -pylväitä kutsutaan vesipitoisiksi C18 -pylväiksi, nimittäin C18AQ -pylväiksi, jotka on suunniteltu erittäin vesipitoisiin eluutio -olosuhteisiin ja voivat sietää 100% vesipitoista järjestelmää. C18AQ-pylväät on levitetty laajasti voimakkaiden polaaristen yhdisteiden, mukaan lukien orgaaniset hapot, peptidit, nukleosidit ja vesiliukoiset vitamiinit, erottamisessa ja puhdistamisessa.
Salaleus on yksi C18AQ -pylväiden tyypillisistä sovelluksista näytteiden salamapuhdistuksessa, mikä poistaa näytteen liuottimen suola- tai puskurikomponentit näytteen levittämisen helpottamiseksi seuraavissa tutkimuksissa. Tässä viestissä Brilliant Blue FCF: tä, jolla oli vahva napaisuus, käytettiin näytteenä ja puhdistettiin C18AQ -pylväässä. Näytteen liuotin korvattiin orgaanisella liuottimella puskuriliuoksesta, mikä helpotti seuraavaa pyörivää haihtumista sekä säästää liuottimia ja käyttöaikaa. Lisäksi näytteen puhtautta parannettiin poistamalla näytteen joitain epäpuhtauksia.
Kokeellinen osa
Kuva 2. Näytteen kemiallinen rakenne.
Brilliant Blue FCF: tä käytettiin näytteenä tässä viestissä. Raakaan näytteen puhtaus oli 86% ja näytteen kemiallinen rakenne esitettiin kuviossa 2. Näyteliuoksen valmistamiseksi 300 mg: n jauhemainen raaka -aine, jolla oli loistavaa sinistä FCF: tä, liuotettiin 1 M NAH2PO4 -puskuriliuokseen ja ravisteli hyvin täysin selväksi liuokseksi. Sitten näyteliuos injektoitiin flash -pylvääseen injektorin avulla. Flash -puhdistuksen kokeellinen asennus on lueteltu taulukossa 1.
| Instrumentti | Sepabean ™ -kone2 | |||
| Patruunat | 12 g Sepaflash C18 RP Flash -patruuna (pallomainen piidioksidi, 20-45 μm, 100 Å, tilausnumero: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash -patruuna (pallomainen piidioksidi, 20-45 μm, 100 Å, tilausnumero ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Aallonpituus | 254 nm | |||
| Liikkuva vaihe | Liuotin A ： vesi Liuotin B ： Metanoli | |||
| Virtausnopeus | 30 ml/min | |||
| Näytteenkuormitus | 300 mg (loistava sininen FCF puhtaus 86%) | |||
| Kaltevuus | Aika (CV) | Liuotin B (%) | Aika (CV) | Liuotin B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Tulokset ja keskustelu
Näytteen suolistossa ja puhdistuksessa käytettiin Sepaflash C18AQ RP -patruuna -patruunaa. Käytettiin vaihegradienttia, jossa puhdasta vettä käytettiin liikkuvana faasina eluution alussa ja ajettiin 10 pylvään tilavuuteen (CV). Kuten kuviossa 3 esitetään, kun käytettiin puhdasta vettä liikkuvana faasina, näyte pidettiin kokonaan flash -patruunassa. Seuraavaksi liikkuvan faasin metanolia nostettiin suoraan 100%: iin ja gradientti ylläpidettiin 7,5 ansioluettelossa. Näyte eluoitiin 11,5 - 13,5 cv. Kerätyissä fraktioissa näyteliuos korvattiin NAH2PO4 -puskuriliuoksesta metanoliin. Verrattuna erittäin vesipitoiseen liuokseen metanolia oli paljon helpompaa poistaa kiertohaihduttamalla seuraavassa vaiheessa, mikä helpottaa seuraavaa tutkimusta.
Kuva 3. Näytteen flash -kromatogrammi C18AQ -patruunassa.
C18AQ -patruunan ja säännöllisen C18 -patruunan retentiokäyttäytymisen vertaamiseksi suoritettiin rinnakkaisvertailutesti. Käytettiin Sepaflash C18 RP -salaman patruunaa ja näytteen flash -kromatogrammi esitettiin kuviossa 4. Tavallisille C18 -patruunoille suurin siedetty vesipitoinen faasisuhde on noin 90%. Siksi aloitusgradientti asetettiin 10% metanoliin 90% vedessä. Kuten kuviossa 4 esitetään, johtuen korkean vesisuhteen aiheuttamien C18 -ketjujen hydrofobisesta faasin romahtamisesta, näyte säilytettiin tuskin tavallisessa C18 Seurauksena on, että näytteen suolanpoistoa tai puhdistamista ei voida suorittaa.
Kuva 4. Näytteen flash -kromatogrammi tavallisella C18 -patruunalla.
Verrattuna lineaariseen gradienttiin, askelgradientin käytöllä on seuraavat edut:
1. Liuottimen käyttö- ja ajonaika näytteen puhdistamisessa vähenee.
2. Kohdetuote suuttuu terävään piikkiin, mikä vähentää kerättyjen fraktioiden määrää ja helpottaa siten seuraavaa kiertohaihdutusta ja säästöaikaa.
3. Kerätty tuote on metanolissa, jota on helppo haihtua, joten kuivausaika lyhenee.
Yhteenvetona voidaan todeta, että näytteen puhdistamiseksi, joka on voimakkaasti polaarinen tai erittäin hydrofiilinen, sepaflash C18AQ RP -salamapatruunat yhdistettynä preparatiiviseen flash -kromatografiajärjestelmään Sepabean ™ -koneella voisi tarjota nopean ja tehokkaan ratkaisun.
Tietoja Sepaflash Bonded -sarjan C18 RP Flash -patruunoista
Siellä on sarja SEPAFlash C18AQ RP -salamapatruunoita, joilla on erilaiset eritelmät SANTAI -tekniikasta (kuten taulukossa 2 esitetään).
| Kohteenumero | Pylväskoko | Virtausnopeus (ml/min) | Enimmäispaine (psi/baari) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Taulukko 2. Sepaflash C18AQ RP Flash -patruunat.
Pakkausmateriaalit: Korkean tehokkuuden pallomainen C18 (AQ) -pidetty piidioksidi, 20-45 μm, 100 Å.
logy (kuten taulukossa 2).
Viestin aika: elokuu 27-2018