هونگ چنگ وانگ، بو خو
مرکز تحقیق و توسعه برنامه
معرفی
با توجه به قطبیت های نسبی فاز ساکن و فاز متحرک، کروماتوگرافی مایع را می توان به کروماتوگرافی فاز عادی (NPC) و کروماتوگرافی فاز معکوس (RPC) تقسیم کرد.برای RPC، قطبیت فاز متحرک قوی تر از فاز ثابت است.RPC به دلیل کارایی بالا، وضوح خوب و مکانیسم ماندگاری شفاف به پرکاربردترین حالت در حالت‌های جداسازی کروماتوگرافی مایع تبدیل شده است.بنابراین RPC برای جداسازی و خالص سازی ترکیبات مختلف قطبی یا غیر قطبی از جمله آلکالوئیدها، کربوهیدرات ها، اسیدهای چرب، استروئیدها، اسیدهای نوکلئیک، اسیدهای آمینه، پپتیدها، پروتئین ها و غیره مناسب است. ماتریس ژل سیلیکا که با گروه های عاملی مختلف از جمله C18، C8، C4، فنیل، سیانو، آمینو و غیره پیوند خورده است.تخمین زده می شود که اکنون بیش از 80 درصد RPC از فاز پیوندی C18 استفاده می کنند.بنابراین ستون کروماتوگرافی C18 به یک ستون جهانی ضروری برای هر آزمایشگاه تبدیل شده است.
اگرچه ستون C18 را می توان در طیف گسترده ای از کاربردها استفاده کرد، با این حال، برای برخی از نمونه ها که بسیار قطبی یا بسیار آبدوست هستند، ستون های C18 معمولی ممکن است هنگام استفاده برای خالص سازی چنین نمونه هایی با مشکل مواجه شوند.در RPC، حلال های شستشوی رایج را می توان با توجه به قطبیت آنها سفارش داد: آب < متانول < استونیتریل < اتانول < تتراهیدروفوران < ایزوپروپانول.برای اطمینان از ماندگاری خوب روی ستون برای این نمونه ها (قطبی قوی یا بسیار آبدوست)، نسبت بالایی از سیستم آبی لازم است که به عنوان فاز متحرک استفاده شود.با این حال، هنگام استفاده از سیستم آب خالص (شامل آب خالص یا محلول نمک خالص) به عنوان فاز متحرک، زنجیره کربنی طولانی در فاز ثابت ستون C18 تمایل به اجتناب از آب و مخلوط شدن با یکدیگر دارد و در نتیجه کاهش آنی در ظرفیت نگهداری ستون یا حتی عدم نگهداری.به این پدیده "فروپاشی فاز آبگریز" می گویند (همانطور که در قسمت چپ شکل 1 نشان داده شده است).اگرچه این وضعیت زمانی که ستون با حلال‌های آلی مانند متانول یا استونیتریل شسته می‌شود برگشت‌پذیر است، اما همچنان می‌تواند باعث آسیب به ستون شود.بنابراین باید از بروز این وضعیت جلوگیری کرد.
شکل 1. نمودار شماتیک فازهای پیوندی روی سطح سیلیکاژل در ستون معمولی C18 (سمت چپ) و ستون C18AQ (راست).
برای رفع مشکلات ذکر شده در بالا، تولید کنندگان مواد بسته بندی کروماتوگرافی پیشرفت های فنی انجام داده اند.یکی از این پیشرفت‌ها انجام برخی اصلاحات در سطح ماتریس سیلیکا است، مانند معرفی گروه‌های سیانو آبدوست (همانطور که در قسمت سمت راست شکل 1 نشان داده شده است)، تا سطح سیلیکاژل را آبدوست‌تر کند.بنابراین زنجیره‌های C18 روی سطح سیلیس می‌توانند به طور کامل تحت شرایط بسیار آبی گسترش یافته و از فروپاشی فاز آبگریز جلوگیری شود.این ستون‌های C18 اصلاح‌شده، ستون‌های آبی C18، یعنی ستون‌های C18AQ نامیده می‌شوند که برای شرایط شستشوی بسیار آبی طراحی شده‌اند و می‌توانند 100% سیستم آبی را تحمل کنند.ستون‌های C18AQ به طور گسترده در جداسازی و خالص‌سازی ترکیبات قطبی قوی، از جمله اسیدهای آلی، پپتیدها، نوکلئوزیدها و ویتامین‌های محلول در آب استفاده شده‌اند.
نمک زدایی یکی از کاربردهای معمول ستون های C18AQ در تصفیه فلاش برای نمونه ها است که نمک یا اجزای بافر موجود در حلال نمونه را حذف می کند تا کاربرد نمونه در مطالعات بعدی تسهیل شود.در این پست از FCF آبی درخشان با قطبیت قوی به عنوان نمونه استفاده شد و بر روی ستون C18AQ خالص سازی شد.حلال نمونه با حلال آلی از محلول بافر جایگزین شد، بنابراین تبخیر چرخشی زیر و همچنین صرفه جویی در حلال ها و زمان عملیاتی را تسهیل می کند.علاوه بر این، خلوص نمونه با حذف برخی ناخالصی ها در نمونه بهبود یافت.
بخش تجربی
شکل 2. ساختار شیمیایی نمونه.
در این پست از FCF آبی درخشان به عنوان نمونه استفاده شده است.خلوص نمونه خام 86 درصد و ساختار شیمیایی نمونه در شکل 2 نشان داده شده است. برای تهیه محلول نمونه، 300 میلی گرم جامد پودری خام Brilliant Blue FCF در محلول بافر 1 مولار NaH2PO4 حل شد و به خوبی تکان داده شد تا تبدیل شود. یک راه حل کاملا شفافسپس محلول نمونه توسط یک انژکتور به ستون فلاش تزریق شد.تنظیمات آزمایشی تصفیه فلاش در جدول 1 فهرست شده است.
| ابزار | ماشین SepaBean™2 | |||
| کارتریج | کارتریج فلش 12 گرمی SepaFlash C18 RP (سیلیکا کروی، 20 - 45 میکرومتر، 100 Å، شماره سفارش: SW-5222-012-SP) | کارتریج فلاش 12 گرمی SepaFlash C18AQ RP (سیلیکا کروی، 20 - 45 میکرومتر، 100 Å، شماره سفارش：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| طول موج | 254 نانومتر | |||
| فاز موبایل | حلال A: آب حلال B: متانول | |||
| نرخ جریان | 30 میلی لیتر در دقیقه | |||
| بارگذاری نمونه | 300 میلی گرم (اف سی اف آبی درخشان با خلوص 86 درصد) | |||
| شیب | زمان (CV) | حلال B (%) | زمان (CV) | حلال B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
نتایج و بحث
برای نمک زدایی و خالص سازی نمونه از کارتریج فلاش SepaFlash C18AQ RP استفاده شد.گرادیان مرحله استفاده شد که در آن آب خالص به عنوان فاز متحرک در شروع شستشو و اجرا برای 10 حجم ستون (CV) استفاده شد.همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، هنگام استفاده از آب خالص به عنوان فاز متحرک، نمونه به طور کامل روی کارتریج فلاش نگه داشته شد.سپس، متانول در فاز متحرک به طور مستقیم به 100٪ افزایش یافت و گرادیان برای 7.5 CV حفظ شد.نمونه از 11.5 تا 13.5 CV شسته شد.در فراکسیون های جمع آوری شده، محلول نمونه از محلول بافر NaH2PO4 به متانول جایگزین شد.در مقایسه با محلول بسیار آبی، حذف متانول با تبخیر چرخشی در مرحله بعدی بسیار آسان‌تر بود، که تحقیقات زیر را تسهیل می‌کند.
شکل 3. کروماتوگرام فلش نمونه روی کارتریج C18AQ.
برای مقایسه رفتار نگهداری کارتریج C18AQ و کارتریج معمولی C18 برای نمونه‌های با قطبیت قوی، آزمون مقایسه موازی انجام شد.یک کارتریج فلاش SepaFlash C18 RP استفاده شد و کروماتوگرام فلاش برای نمونه در شکل 4 نشان داده شده است. برای کارتریج های معمولی C18، بالاترین نسبت فاز آبی قابل تحمل حدود 90٪ است.بنابراین گرادیان شروع بر روی 10 درصد متانول در 90 درصد آب تنظیم شد.همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، به دلیل فروپاشی فاز آبگریز زنجیره های C18 ناشی از نسبت آبی بالا، نمونه به سختی روی کارتریج معمولی C18 نگه داشته شد و مستقیماً توسط فاز متحرک شسته شد.در نتیجه عملیات نمک زدایی یا تصفیه نمونه نمی تواند کامل شود.
شکل 4. کروماتوگرام فلش نمونه بر روی یک کارتریج معمولی C18.
در مقایسه با گرادیان خطی، استفاده از گرادیان گام دارای مزایای زیر است:
1. مصرف حلال و زمان اجرا برای خالص سازی نمونه کاهش می یابد.
2. محصول مورد نظر در یک پیک تیز شسته می شود، که باعث کاهش حجم فراکسیون های جمع آوری شده و در نتیجه تسهیل تبخیر چرخشی زیر و همچنین صرفه جویی در زمان می شود.
3. محصول جمع آوری شده در متانول است که به راحتی تبخیر می شود، بنابراین زمان خشک شدن کاهش می یابد.
در نتیجه، برای خالص‌سازی نمونه‌ای که به شدت قطبی یا بسیار آبدوست است، کارتریج‌های فلش SepaFlash C18AQ RP که با سیستم کروماتوگرافی فلش مقدماتی SepaBean™ Machine ترکیب می‌شوند، می‌توانند راه‌حلی سریع و کارآمد ارائه دهند.
درباره کارتریج های فلش SepaFlash Bonded Series C18 RP
یک سری کارتریج فلش SepaFlash C18AQ RP با مشخصات متفاوت از Santai Technology (همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است) وجود دارد.
| شماره مورد | اندازه ستون | نرخ جریان (میلی لیتر در دقیقه) | حداکثر فشار (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 گرم | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 گرم | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 گرم | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 گرم | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 گرم | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 گرم | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 گرم | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 گرم | 40-80 | 250/17.2 |
جدول 2. کارتریج فلش SepaFlash C18AQ RP.
مواد بسته بندی: سیلیس کروی با باند C18 (AQ) با کارایی بالا، 20 - 45 میکرومتر، 100 Å.
logy (همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است).
زمان ارسال: اوت-27-2018