Hongcheng Wang ، Bo Xu
مرکز تحقیق و توسعه برنامه
مقدمه
با توجه به قطب های نسبی فاز ثابت و فاز متحرک ، کروماتوگرافی مایع را می توان به کروماتوگرافی فاز طبیعی (NPC) و کروماتوگرافی فاز معکوس (RPC) تقسیم کرد. برای RPC ، قطبیت فاز متحرک از مرحله ثابت قوی تر است. RPC به دلیل راندمان بالا ، وضوح خوب و مکانیسم نگهدارنده روشن ، در حالت های جداسازی کروماتوگرافی مایع به طور گسترده ای مورد استفاده قرار گرفته است. بنابراین RPC برای جداسازی و تصفیه ترکیبات مختلف قطبی یا غیر قطبی از جمله آلکالوئیدها ، کربوهیدرات ها ، اسیدهای چرب ، استروئیدها ، اسیدهای آمینه ، اسیدهای آمینه ، پپتیدها ، پروتئین ها و غیره مناسب است. آمینه و غیره در میان این گروه های عملکردی پیوند خورده ، بیشترین استفاده از آن C18 است. تخمین زده می شود که اکنون بیش از 80 ٪ RPC از فاز پیوند شده C18 استفاده می کنند. بنابراین ستون کروماتوگرافی C18 برای هر آزمایشگاه به یک ستون جهانی ضروری تبدیل شده است.
اگرچه ستون C18 می تواند در طیف بسیار گسترده ای از برنامه ها استفاده شود ، اما برای برخی از نمونه هایی که بسیار قطبی یا بسیار آبگریز هستند ، ستون های معمولی C18 ممکن است هنگام استفاده از این نمونه ها مشکل داشته باشند. در RPC ، حلالهای شستشوی متداول می توانند با توجه به قطبیت آنها سفارش دهند: آب <متانول <استونیتریل <اتانول <تتراهیدروفوران <ایزوپروپانول. برای اطمینان از احتباس خوب در ستون برای این نمونه ها (قطبی قوی یا بسیار آبگریز) ، نسبت زیادی از سیستم آبی برای استفاده به عنوان فاز متحرک لازم است. با این حال ، هنگام استفاده از سیستم آب خالص (از جمله آب خالص یا محلول نمک خالص) به عنوان فاز متحرک ، زنجیره کربن طولانی در فاز ثابت ستون C18 تمایل به جلوگیری از آب و مخلوط کردن با یکدیگر دارد و در نتیجه کاهش فوری ظرفیت احتباس ستون یا حتی بدون احتباس وجود دارد. این پدیده "فروپاشی فاز آبگریز" نامیده می شود (همانطور که در قسمت سمت چپ شکل 1 نشان داده شده است). اگرچه این وضعیت هنگام شستن ستون با حلال های آلی مانند متانول یا استونیتریل قابل برگشت است ، اما هنوز هم می تواند به ستون آسیب برساند. بنابراین ، لازم است از وقوع این وضعیت جلوگیری شود.
شکل 1. نمودار شماتیک مراحل پیوند شده بر روی سطح ژل سیلیس در ستون معمولی C18 (سمت چپ) و ستون C18AQ (سمت راست).
برای پرداختن به مشکلات فوق ، تولید کنندگان مواد بسته بندی کروماتوگرافی پیشرفت های فنی را انجام داده اند. یکی از این پیشرفت ها ، ایجاد برخی از اصلاحات در سطح ماتریس سیلیس ، مانند معرفی گروه های سیانو هیدروفیل (همانطور که در قسمت سمت راست شکل 1 نشان داده شده است) ، برای اینکه سطح ژل سیلیس آبگریزتر شود. بنابراین زنجیره های C18 در سطح سیلیس می توانند در شرایط بسیار آبی به طور کامل گسترش یابد و از سقوط فاز آبگریز جلوگیری شود. این ستون های اصلاح شده C18 به ستون های آبی C18 گفته می شوند ، یعنی ستون های C18AQ ، که برای شرایط شستشوی بسیار آبی طراحی شده اند و می توانند 100 ٪ سیستم آبی را تحمل کنند. ستون های C18AQ به طور گسترده ای در جداسازی و تصفیه ترکیبات قطبی قوی ، از جمله اسیدهای آلی ، پپتیدها ، نوکلئوزیدها و ویتامین های محلول در آب استفاده شده است.
نمک زدایی یکی از کاربردهای معمولی ستون های C18AQ در تصفیه فلاش برای نمونه ها است که برای تسهیل کاربرد نمونه در مطالعات بعدی ، نمک یا اجزای بافر را در حلال نمونه حذف می کند. در این پست ، FCF آبی درخشان با قطبیت قوی به عنوان نمونه استفاده شد و در ستون C18AQ خالص شد. حلال نمونه توسط حلال آلی از محلول بافر جایگزین شد ، بنابراین تبخیر دوار زیر و همچنین صرفه جویی در حلال ها و زمان کار را تسهیل می کند. علاوه بر این ، با از بین بردن برخی ناخالصی ها در نمونه ، خلوص نمونه بهبود یافته است.
بخش تجربی
شکل 2 ساختار شیمیایی نمونه.
FCF آبی درخشان به عنوان نمونه در این پست استفاده شد. خلوص نمونه خام 86 ٪ و ساختار شیمیایی نمونه در شکل 2 نشان داده شده است. برای تهیه محلول نمونه ، 300 میلی گرم جامد نفت خام پودری از FCF آبی درخشان در محلول بافر 1 M NAH2PO4 حل شد و به خوبی لرزید تا به یک راه حل کاملاً واضح تبدیل شود. محلول نمونه سپس توسط یک انژکتور به ستون فلش تزریق شد. تنظیم آزمایشی تصفیه فلش در جدول 1 ذکر شده است.
| ابزار | دستگاه Sepabean.2 | |||
| کارتریج | 12 گرم کارتریج فلش Sepaflash C18 Rp (سیلیس کروی ، 20-45 میکرومتر ، 100 Å ، شماره سفارش: SW-5222-012-SP) | 12 گرم کارتریج فلش Sepaflash C18AQ RP (سیلیس کروی ، 20-45 میکرومتر ، 100 Å ، شماره سفارش ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| طول موج | 254 نیوتن متر | |||
| مرحله متحرک | حلال A ： آب حلال B ： متانول | |||
| میزان جریان | 30 میلی لیتر در دقیقه | |||
| بارگذاری نمونه | 300 میلی گرم (FCF آبی درخشان با خلوص 86 ٪) | |||
| شیب | زمان (CV) | حلال B (٪) | زمان (CV) | حلال B (٪) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
نتایج و بحث
از کارتریج فلش Sepaflash C18AQ RP برای نمونه گیری و تصفیه نمونه استفاده شد. از شیب مرحله استفاده شد که در آن از آب خالص به عنوان فاز متحرک در شروع شستشو استفاده شد و برای 10 جلد ستون (CV) اجرا شد. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است ، هنگام استفاده از آب خالص به عنوان فاز متحرک ، نمونه به طور کامل در کارتریج فلش حفظ شد. در مرحله بعد ، متانول در فاز متحرک به طور مستقیم به 100 ٪ افزایش یافت و شیب برای 7.5 CV حفظ شد. نمونه از 11.5 به 13.5 CV منتقل شد. در بخش های جمع آوری شده ، محلول نمونه از محلول بافر NAH2PO4 به متانول جایگزین شد. در مقایسه با محلول بسیار آبی ، متانول با تبخیر چرخشی در مرحله بعدی بسیار ساده تر بود ، که تحقیقات زیر را تسهیل می کند.
شکل 3 کروماتوگرام فلش نمونه در کارتریج C18AQ.
برای مقایسه رفتار احتباس کارتریج C18AQ و کارتریج معمولی C18 برای نمونه های قطبیت قوی ، تست مقایسه موازی انجام شد. از کارتریج فلش Sepaflash C18 RP استفاده شد و کروماتوگرام فلش برای نمونه در شکل 4 نشان داده شده است. برای کارتریج های معمولی C18 ، بالاترین نسبت فاز آبی تحمل حدود 90 ٪ است. بنابراین گرادیان شروع در 10 ٪ متانول در 90 ٪ آب تنظیم شد. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است ، با توجه به فروپاشی فاز آبگریز زنجیرهای C18 ناشی از نسبت آبی بالا ، نمونه به سختی در کارتریج معمولی C18 حفظ شد و مستقیماً توسط فاز متحرک بیرون آمد. در نتیجه ، عملکرد نمک زدایی یا تصفیه نمونه نمی تواند انجام شود.
شکل 4. کروماتوگرام فلش نمونه بر روی کارتریج معمولی C18.
در مقایسه با شیب خطی ، استفاده از گرادیان مرحله مزایای زیر را دارد:
1. استفاده از حلال و زمان اجرا برای تصفیه نمونه کاهش می یابد.
2. محصول هدف در اوج تیز قرار می گیرد ، که حجم کسری جمع آوری شده را کاهش می دهد و در نتیجه تبخیر دوار زیر و همچنین صرفه جویی در زمان را تسهیل می کند.
3. محصول جمع آوری شده در متانول است که به راحتی تبخیر می شود ، بنابراین زمان خشک شدن کاهش می یابد.
در نتیجه ، برای تصفیه نمونه ای که به شدت قطبی یا بسیار آبگریز است ، کارتریج های فلش Sepaflash C18AQ RP با ترکیب با سیستم کروماتوگرافی فلش مقدماتی Sepabean ™ می تواند یک راه حل سریع و کارآمد را ارائه دهد.
درباره کارتریج های فلش Sepaflash Series C18 RP
مجموعه ای از کارتریج های فلش Sepaflash C18AQ RP با مشخصات مختلف از فناوری Santai (همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است) وجود دارد.
| شماره مورد | اندازه ستون | میزان جریان (ML/min) | max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 گرم | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 گرم | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 گرم | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 گرم | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 گرم | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 گرم | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-52222220-SP (AQ) | 300 گرم | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 گرم | 40-80 | 250/17.2 |
جدول 2. کارتریج های فلش Sepaflash C18AQ RP.
مواد بسته بندی: سیلیس کروی C18 (AQ) با راندمان بالا ، 20-45 میکرومتر ، 100.
logy (همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است).
زمان پست: اوت -27-2018