Rui Huang, Bo Xu
Aplikazio I+G Zentroa
Sarrera
Peptido bat aminoazidoz osatutako konposatu bat da, eta horietako bakoitzak propietate fisiko eta kimiko bereziak ditu bere sekuentzia osatzen duten aminoazidoen hondakinen mota eta ordena ezberdinengatik.Fase solidoaren sintesi kimikoaren garapenarekin, hainbat peptido aktiboren sintesi kimikoak aurrerapen handia egin du.Hala ere, fase solidoaren sintesian lortutako peptidoaren konposizio korapilatsuaren ondorioz, azken produktua bereizketa-metodo fidagarrien bidez araztu behar da.Peptidoen arazketa-metodoak ohikoak dira ioi-trukearen kromatografia (IEC) eta errendimendu handiko kromatografia likidoaren alderantzizko fasea (RP-HPLC), laginak kargatzeko ahalmen baxua, bereizketa komunikabideen kostu handia, bereizketa ekipamendu korapilatsu eta garestiak dituzten desabantailak. etab. Molekula txikiko peptidoen (MW < 1 kDa) arazteko, aurretik Santai Technologies-ek aplikazio-kasu arrakastatsu bat argitaratu zuen, non SepaFlash RP C18 kartutxo bat erabili zen timopentina (TP-5) azkar arazteko eta baldintzak betetzen dituen xede-produktua lortu da.
1. irudia. 20 aminoazido arrunt (www.bachem.com-etik erreproduzituak).
Peptidoen konposizioan ohikoak diren 20 aminoazido mota daude.Aminoazido hauek polaritatearen eta azido-base propietatearen arabera talde hauetan bana daitezke: ez polarrak (hidrofoboak), polarrak (kargarik gabeak), azidoak edo basikoak (1. irudian ikusten den bezala).Sekuentzia peptidiko batean, sekuentzia osatzen duten aminoazidoak polarrak badira (1. irudian kolore arrosaz markatuta dagoen moduan), hala nola, zisteina, glutamina, asparagina, serina, treonina, tirosina, etab., orduan peptido honek indartsua izan dezake. polaritatea eta uretan oso disolbagarriak izatea.Alderantzizko faseko kromatografiaren bidez peptido polar lagin sendo hauen arazketa-prozeduran zehar, fase hidrofobikoaren kolapsoa izeneko fenomenoa gertatuko da (ikus Santai Technologies-ek aurrez argitaratutako aplikazio-ohar bat: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).C18 zutabe arruntekin alderatuta, C18AQ zutabe hobetuak egokienak dira lagin polar edo hidrofilo indartsuak arazteko.Argitalpen honetan, peptido polar indartsu bat erabili zen lagin gisa eta C18AQ zutabe baten bidez purifikatu zen.Ondorioz, baldintzak betetzen zituen xede-produktua lortu zen eta ondorengo ikerketa eta garapenean erabil zitekeen.
| Instrumentua | SepaBean™makina 2 | |||
| Kartutxoak | 12 g SepaFlash C18 RP flash kartutxoa (silize esferikoa, 20 - 45 μm, 100 Å, Eskaera zenbakia: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash kartutxoa (silize esferikoa, 20 - 45 μm, 100 Å, Eskaera zenbakia: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Uhin-luzera | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Fase mugikorra | A disolbatzailea: ura B disolbatzailea: azetonitrilo | |||
| Jario tasa | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Laginak kargatzea | 30 mg | |||
| Gradientea | Denbora (CV) | B disolbatzailea (%) | Denbora (min) | B disolbatzailea (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Emaitzak eta eztabaida
C18 zutabe arruntaren eta C18AQ zutabearen arteko peptido polarraren laginaren arazketa-errendimendua alderatzeko, C18 zutabe arrunt bat erabili dugu laginaren flash-arazterako.2. Irudian ikusten den bezala, C18 kateen fase hidrofoboaren kolapsoaren ondorioz, ur-erlazio altua dela eta, lagina ia ez zen C18 kartutxo arruntean atxiki eta zuzenean kanporatu zen fase mugikorraren bidez.Ondorioz, lagina ez zen modu eraginkorrean banandu eta araztu.
2. Irudia. C18 kartutxo arrunt batean laginaren flash-kromatograma.
Ondoren, C18AQ zutabe bat erabili dugu laginaren flash-arazketarako.3. Irudian erakusten den moduan, peptidoa zutabean modu eraginkorrean atxiki eta gero eluitu egin zen.Helburuko produktua lagin gordineko ezpurutasunetatik bereizi eta bildu zen.Liofilizazioaren ondoren eta HPLC bidez aztertu ondoren, araztutako produktuak % 98,2ko purutasuna du eta hurrengo urratseko ikerketa eta garapenerako erabil liteke.
3. Irudia. Laginaren flash-kromatograma C18AQ kartutxo batean.
Ondorioz, SepaFlash C18AQ RP flash kartutxoa SepaBean flash kromatografia sistemarekin konbinatuta.™makinak soluzio azkarra eta eraginkorra eskain dezake lagin polar edo hidrofilo sendoak arazteko.
Santai Technologyren zehaztapen desberdinak dituzten SepaFlash C18AQ RP flash kartutxoak daude (2. taulan agertzen den bezala).
| Elementu zenbakia | Zutabearen tamaina | Jario tasa (ml/min) | Max.Presioa (psi/barra) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
2. taula. SepaFlash C18AQ RP flash kartutxoak.Enbalatzeko materialak: eraginkortasun handiko C18 (AQ) loturiko silizea, 20 - 45 μm, 100 Å.
SepaBean™ makinaren zehaztapen zehatzei edo SepaFlash serieko flash kartutxoei buruzko informazio gehiago lortzeko, bisitatu gure webgunea.
Argitalpenaren ordua: 2018-10-12