Hongcheng Wang, Bo Xu
Aplikazio I+G Zentroa
Sarrera
Fase geldikorraren eta fase mugikorren polaritate erlatiboen arabera, kromatografia likidoa fase normaleko kromatografia (NPC) eta fase alderantzizko kromatografia (RPC) bana daiteke.RPC-rako, fase mugikorraren polaritatea fase geldiarena baino indartsuagoa da.Kromatografia likidoaren bereizketa-moduetan gehien erabiltzen dena bihurtu da RPC eraginkortasun handiagatik, bereizmen onagatik eta atxikipen-mekanismo argiagatik.Horregatik, RPC egokia da hainbat konposatu polar edo ez-polar bereizteko eta arazteko, besteak beste, alkaloideak, karbohidratoak, gantz-azidoak, esteroideak, azido nukleikoak, aminoazidoak, peptidoak, proteinak, etab. RPCn, gehien erabiltzen den fase geldikoa da. silize gel-matrizea hainbat talde funtzionalrekin lotzen dena, besteak beste, C18, C8, C4, fenilo, ziano, amino, etab. Lotutako talde funtzional horien artean, gehien erabiltzen dena C18 da.Kalkulatzen da RPCren % 80 baino gehiago C18 loturiko fasea erabiltzen ari dela.Beraz, C18 kromatografia-zutabea ezinbesteko zutabe unibertsala bihurtu da laborategi guztietan.
C18 zutabea oso aplikazio sorta zabalean erabil daitekeen arren, oso polarrak edo oso hidrofiloak diren lagin batzuetarako, C18 zutabe arruntek arazoak izan ditzakete lagin horiek arazteko erabiltzen direnean.RPCn, erabili ohi diren eluzio-disolbatzaileak polaritatearen arabera ordena daitezke: ura < metanola < azetonitrilo < etanola < tetrahidrofuranoa < isopropanola.Lagin hauen zutabean atxikipen ona ziurtatzeko (polar indartsua edo oso hidrofiloa), fase mugikor gisa erabili behar da ur-sistemaren proportzio handia.Hala ere, fase mugikor gisa ur puruaren sistema (ur purua edo gatz-disoluzio purua barne), C18 zutabearen fase geldikorreko karbono-kate luzeak ura saihestu eta elkarren artean nahasteko joera du, eta ondorioz, berehalako murrizketa da. zutabearen atxikipen-ahalmena edo are atxikimendurik ez.Fenomeno honi "fase hidrofobikoa kolapsoa" deitzen zaio (1. irudiaren ezkerreko zatian ikusten den bezala).Egoera hau itzulgarria den arren, zutabea disolbatzaile organikoekin garbitzen denean, hala nola metanola edo azetonitriloa, hala ere, zutabeari kalte egin diezaioke.Horregatik, beharrezkoa da egoera hori gerta ez dadin.
1. Irudia. Lotutako faseen diagrama eskematikoa C18 zutabe arruntean (ezkerrean) eta C18AQ zutabean (eskuinean) silize gelaren gainazalean.
Aipatutako arazoei aurre egiteko, ontziratzeko material kromatografikoen fabrikatzaileek hobekuntza teknikoak egin dituzte.Hobekuntza horietako bat silize-matrizearen gainazalean aldaketa batzuk egitea da, hala nola, ziano-talde hidrofiloak sartzea (1. Irudiaren eskuineko zatian ikusten den bezala), silize gelaren gainazala hidrofiloagoa izan dadin.Horrela, silizearen gainazaleko C18 kateak guztiz hedatu litezke baldintza oso urtsuetan eta fase hidrofobikoa kolapsoa saihestu liteke.Aldatutako C18 zutabe horiei C18 zutabe urtsuak deitzen zaie, hots, C18AQ zutabeak, ur handiko eluzio-baldintzetarako diseinatuta daudenak eta %100eko sistema urtsua jasan dezaketenak.C18AQ zutabeak oso erabiliak izan dira konposatu polar indartsuen bereizketa eta arazketan, azido organikoak, peptidoak, nukleosidoak eta uretan disolbagarriak diren bitaminak barne.
Gatza kentzea C18AQ zutabeen aplikazio tipikoetako bat da laginen flash-araztean, laginaren disolbatzaileko gatza edo buffer osagaiak kentzen dituena, ondorengo ikerketetan lagina aplikatzea errazteko.Argitalpen honetan, polaritate handia duen Brilliant Blue FCF lagin gisa erabili eta C18AQ zutabean araztu zen.Laginaren disolbatzailea tampon-disoluzioko disolbatzaile organikoarekin ordezkatu zen, eta, horrela, ondorengo lurrunketa birakaria erraztu zen, baita disolbatzaileak eta funtzionamendu-denbora aurreztea ere.Gainera, laginaren purutasuna hobetu zen laginaren ezpurutasun batzuk kenduz.
Atala Esperimentala
2. Irudia. Laginaren egitura kimikoa.
Brilliant Blue FCF lagin gisa erabili zen argitalpen honetan.Lagin gordinaren purutasuna % 86koa zen eta laginaren egitura kimikoa 2. Irudian erakusten zen. Laginaren disoluzioa prestatzeko, Brilliant Blue FCF-ren 300 mg solido gordina hautsezko NaH2PO4 1 M soluzio tamponan disolbatu zen eta ondo astindu zen. irtenbide guztiz argia.Lagin-disoluzioa injektore baten bidez flash zutabean injektatu zen.Flash-arazketaren konfigurazio esperimentala 1. taulan ageri da.
| Instrumentua | SepaBean™ Makina2 | |||
| Kartutxoak | 12 g SepaFlash C18 RP flash kartutxoa (silize esferikoa, 20 - 45 μm, 100 Å, Eskaera zenbakia: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash kartutxoa (silize esferikoa, 20 - 45 μm, 100 Å, Eskaera zenbakia: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Uhin-luzera | 254 nm | |||
| Fase mugikorra | A disolbatzailea: ura B disolbatzailea: metanola | |||
| Jario tasa | 30 ml/min | |||
| Laginak kargatzea | 300 mg (Brillant Blue FCF % 86ko garbitasunarekin | |||
| Gradientea | Denbora (CV) | B disolbatzailea (%) | Denbora (CV) | B disolbatzailea (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Emaitzak eta eztabaida
SepaFlash C18AQ RP flash kartutxo bat erabili zen laginak gatzgabetzeko eta arazteko.Etapa-gradientea erabili zen eta bertan ur purua fase mugikor gisa erabili zen eluzioaren hasieran eta 10 zutabe-bolumenetan (CV) exekutatu zen.3. Irudian ikusten den bezala, fase mugikor gisa ur purua erabiltzean, lagina guztiz atxiki zen flash-kartutxoan.Ondoren, fase mugikorrean metanola zuzenean %100era igo zen eta gradientea 7,5 CV-rako mantendu zen.Lagina 11,5etik 13,5 CV-ra atera zen.Bildutako frakzioetan, lagin-disoluzioa NaH2PO4 tampon-disoluziotik metanola ordezkatu zen.Oso urtsua den disoluzioarekin alderatuz gero, metanola askoz errazagoa zen lurrunketa birakari bidez kentzea hurrengo urratsean, eta horrek ikerketa errazten du.
3. Irudia. Laginaren flash-kromatograma C18AQ kartutxo batean.
Polaritate handiko laginetarako C18AQ kartutxoaren eta C18 kartutxo arruntaren atxikipen portaera alderatzeko, konparazio proba paraleloa egin zen.SepaFlash C18 RP flash-kartutxoa erabili zen eta laginaren flash-kromatograma 4. Irudian erakutsi zen. C18 kartutxo arruntetarako, fase urtsuen proportziorik altuena % 90 ingurukoa da.Beraz, hasierako gradientea % 10eko metanola ezarri zen, % 90eko uretan.4. Irudian ikusten den bezala, C18 kateen fase hidrofobikoaren kolapsoaren ondorioz, ur-erlazio altua dela eta, lagina ia ez zen C18 kartutxo arruntean atxiki eta fase mugikorraren bidez zuzenean kanporatu zen.Ondorioz, ezin da laginak gatzgabetzeko edo arazteko eragiketa burutu.
4. Irudia. C18 kartutxo arrunt batean laginaren flash-kromatograma.
Gradiente linealarekin alderatuz gero, urrats gradientea erabiltzeak abantaila hauek ditu:
1. Disolbatzaileen erabilera eta laginak arazteko denbora murrizten da.
2. Helburuko produktua gailur zorrotz batean elutzen da, eta horrek bildutako frakzioen bolumena murrizten du eta, horrela, ondoko lurruntze birakaria errazten du, baita denbora aurrezten ere.
3. Bildutako produktua metanolean dago eta erraz lurruntzen den, beraz, lehortzeko denbora murrizten da.
Ondorioz, oso polarra edo oso hidrofiloa den laginaren arazketarako, SepaFlash C18AQ RP flash-kartutxoak SepaBean™ Machine prestatzeko flash kromatografia-sistemarekin konbinatuz irtenbide azkarra eta eraginkorra eskain dezakete.
SepaFlash Bonded Series C18 RP flash kartutxoei buruz
Santai Technologyren zehaztapen desberdinak dituzten SepaFlash C18AQ RP flash kartutxoak daude (2. taulan agertzen den bezala).
| Elementu zenbakia | Zutabearen tamaina | Jario tasa (ml/min) | Max.Presioa (psi/barra) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
2. taula. SepaFlash C18AQ RP flash kartutxoak.
Enbalatzeko materialak: eraginkortasun handiko C18 (AQ) loturiko silizea, 20 - 45 μm, 100 Å.
logikoa (2. taulan agertzen den bezala).
Argitalpenaren ordua: 2018-abuztuaren 27a