Rui Huang, Bo Xu
Rakenduse teadus- ja arendustegevuse keskus
Sissejuhatus
Peptiid on ühend, mis koosneb aminohapetest, millest igaühel on ainulaadsed füüsikalised ja keemilised omadused selle järjestuse moodustavate aminohapete jääkide eri tüüpi ja järjekorra tõttu. Tahke faasi keemilise sünteesi väljatöötamisel on mitmesuguste aktiivsete peptiidide keemiline süntees teinud suuri edusamme. Tahke faasi sünteesi abil saadud peptiidi keeruka koostise tõttu tuleks lõppprodukt puhastada usaldusväärsete eraldusmeetodite abil. Peptiidide tavaliselt kasutatavate puhastusmeetodite hulka kuuluvad ioonvahetuskromatograafia (IEC) ja vastupidine faasi kõrgtehnoloogiline vedelikkromatograafia (RP-HPLC), millel on madala proovimahu mahutavuse puudused, kõrged eraldusmeediumid, keerulised ja kulukad eraldamisseadmed jne. Väikemolekulite tempoliste kiired puhastamise (MW <1 kDa) kiired puhastamise. Tümopentiini (TP-5) kiireks puhastamiseks kasutati Sepaflash RP C18 kassetti ja nõuetele vastav sihttoode saadi.
Joonis 1. 20 Levinud aminohapped (reprodutseeritud saidilt www.bachem.com).
Peptiidide koostises on levinud 20 tüüpi aminohappeid. Neid aminohappeid saab jagada järgmisteks rühmadeks vastavalt nende polaarsusele ja happe-aluse omadusele: mittepolaarne (hüdrofoobne), polaarne (laadimata), happeline või baasiline (nagu on näidatud joonisel 1). Peptiidijärjestuses, kui järjestust moodustavad aminohapped on enamasti polaarsed (nagu joonisel 1 tähistatud roosa värviga), näiteks tsüsteiin, glutamiin, asparagiin, seriin, treoniin, türosiin jne, võib sellel peptiidil olla tugev polaarsus ja vees tugevalt lahustuda. Nende tugevate polaarsete peptiidiproovide puhastusprotseduuri ajal pöördfaasiliste kromatograafia abil toimub nähtus, mida nimetatakse hüdrofoobseks faasikokkuleppes (viidake Santai Technologiesi eelnevalt avaldatud rakenduse märkusele: hüdrofoobse faasi kokkuvarisemise, AQ pöördfaasikromatograafia veerud ja nende rakendused). Võrreldes tavaliste C18 sammastega, sobivad täiustatud C18AQ veerud tugeva polaar- või hüdrofiilsete proovide puhastamiseks. Selles postituses kasutati proovina tugevat polaarpeptiidi ja puhastati C18AQ kolonni abil. Selle tulemusel saadi nõuetele vastav sihttoode ja neid saab kasutada järgmises uurimistöös ja arendustegevuses.
| Instrument | Seebik™masin 2 | |||
| Padrunid | 12 g Sepaflash C18 RP välkikassetti (sfääriline ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å, tellimisnunber ： SW-5222-012-sp) | 12 g Sepaflash C18AQ RP välkikassetti (sfääriline ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å, tellimisnumber ： SW-5222-012-SP (AQ)) | ||
| Lainepikkus | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobiilne etapp | Lahusti a: vesi Lahusti B: atsetonitriil | |||
| Voolukiirus | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Proovi laadimine | 30 mg | |||
| Gradient | Aeg (CV) | Lahusti B (%) | Aeg (min) | Lahusti B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1,0 | 0 | 1,0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Tulemused ja arutelu
Polaarse peptiidiproovi puhastus jõudluse võrdlemiseks tavalise C18 veeru ja C18AQ veeru vahel kasutasime proovi käivitamiseks tavalise C18 veeru. Nagu on näidatud joonisel 2, hoiti proovi C18 ahelate C18 ahelate hüdrofoobse faasi kokkuvarisemise tõttu tavalisel C18 kassetil vaevalt ja elueeriti otseselt liikuva faasi abil. Selle tulemusel ei olnud proovi tõhusalt eraldatud ja puhastatud.
Joonis 2. Proovi välklambi kromatogramm tavalisel C18 kassetil.
Järgmisena kasutasime proovi välklambi puhastamiseks C18AQ veergu. Nagu on näidatud joonisel 3, säilitati peptiid kolonni tõhusalt ja elueeriti seejärel välja. Sihtprodukt eraldati toorproovi lisanditest ja koguti. Pärast lüofiliseerimist ja seejärel HPLC abil analüüsimist on puhastatud toote puhtus 98,2% ja seda saab järgmise sammu uurimiseks ja arendamiseks täiendavalt kasutada.
Joonis 3. Proovi välklambi kromatogramm C18AQ kassetil.
Kokkuvõtteks võib öelda, et Sepaflash C18AQ RP välkhoobid koos välgukromatograafilise süsteemiga Sepabea™Masin võiks pakkuda kiiret ja tõhusat lahendust tugevate polaar- või hüdrofiilsete proovide puhastamiseks.
Seal on seeria Sepaflash C18AQ RP välkpunktid, millel on Santai tehnoloogia erinevad spetsifikatsioonid (nagu on näidatud tabelis 2).
| Üksuse number | Veerusuurus | Voolukiirus (ml/min) | Maksimaalne rõhk (PSI/BAR) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-sp (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-sp (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-sp (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-sp (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-sp (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabel 2. Sepaflash C18AQ RP välkpuhnad. Pakkematerjalid: ülitõhusa sfäärilise C18 (AQ) lisatud ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å.
Lisateavet Sepabean ™ masina üksikasjalike spetsifikatsioonide või Sepaflash Series Flashikassettide tellimise kohta leiate meie veebisaidilt.
Postiaeg: 12. oktoober 2018