Hongcheng Wang, Bo Xu
Rakenduse teadus- ja arendustegevuse keskus
Sissejuhatus
Statsionaarse faasi ja liikuva faasi suhtelise polaarsuse kohaselt saab vedelikkromatograafia jagada normaalfaasi kromatograafiaks (NPC) ja vastupidiseks faasikromatograafiaks (RPC). RPC jaoks on liikuva faasi polaarsus tugevam kui statsionaarse faasi oma. RPC on muutunud kõige laialdasemalt kasutatavaks vedelikkromatograafia eraldusrežiimides selle suure efektiivsuse, hea eraldusvõime ja selge säilitusmehhanismi tõttu. Seetõttu sobib RPC mitmesuguste polaarsete või mittepolaarsete ühendite, sealhulgas alkaloidide, süsivesikute, rasvhapete, steroidide, nukleiinhapete, aminohapete, peptiidide, valkude jms eraldamiseks ja puhastamiseks. RPC-s on RPC-s kõige rohkem kasutatav statsionaarne faas, mis on silikaallikate maatrikus, mis on seotud erinevate funktsionaalsete rühmadega, mis on seotud C8-ga, C8-ga. Amino jne. Nende ühendatud funktsionaalrühmade hulgas on kõige laialdasemalt kasutatav C18. Arvatakse, et enam kui 80% RPC -st kasutab nüüd C18 sideme faasi. Seetõttu on C18 kromatograafia kolonn muutunud iga labori jaoks vajalikuks universaalseks veeruks.
Kuigi C18 veergu saab kasutada väga laias valikus rakendustes, võib mõne proovi jaoks, mis on väga polaarne või väga hüdrofiilne, tavalistel C18 veergudel selliste proovide puhastamiseks. RPC -s saab tavaliselt kasutatavaid elueerimislahusteid tellida vastavalt nende polaarsusele: vesi <metanool <atsetonitriil <etanool <tetrahüdrofuran <isopropanool. Nende proovide (tugev polaarne või väga hüdrofiilne) veeru hea säilitamise tagamiseks on liikuva faasina kasutamiseks vaja suurt vesisüsteemi osakaal. Kui aga kasutate puhast veesüsteemi (sealhulgas puhast vett või puhast soolalahust) liikuva faasina, kipub C18 kolonni statsionaarse faasi pikk süsinikuahel vett vältima ja üksteisega segunema, mille tulemuseks on kolonni peetumisvõime hetkeline vähenemine või isegi säilitamiseta. Seda nähtust nimetatakse hüdrofoobse faasi kokkuvarisemiseks (nagu on näidatud joonise 1 vasakus osas). Ehkki see olukord on pöörduv, kui kolonni pestakse selliste orgaaniliste lahustitega nagu metanool või atsetonitriil, võib see siiski kahjustada kolonni. Seetõttu on vaja seda olukorda vältida.
Joonis 1. Ränidioksiidi geeli pinnal olevate ühendusega faaside skemaatiline diagramm tavalises C18 kolonnis (vasakul) ja C18AQ kolonnis (paremal).
Ülalnimetatud probleemide lahendamiseks on kromatograafilised pakkematerjalid tootjad teinud tehnilisi parandusi. Üks neist parandustest on ränidioksiidi maatriksi pinnal mõnede modifikatsioonide tegemine, näiteks hüdrofiilsete tsüanorühmade sissetoomine (nagu on näidatud joonise 1 paremas osas), et muuta ränidioksiidi geeli pind hüdrofiilsemaks. Seega saab ränidioksiidi pinnal olevaid C18 ahelaid tugevalt vesioludes täielikult laiendada ja hüdrofoobset faasi kokkuvarisemist saab vältida. Neid modifitseeritud C18 veergusid nimetatakse C18 vesiveeks, nimelt C18AQ veergudeks, mis on mõeldud väga vesilahustingimuste jaoks ja saavad taluda 100% -list vesisüsteemi. C18AQ sambaid on laialdaselt kasutatud tugevate polaarsete ühendite, sealhulgas orgaaniliste hapete, peptiidide, nukleosiidide ja vees lahustuvate vitamiinide eraldamisel ja puhastamisel.
Magestamine on üks tüüpilisi C18AQ -veergude rakendusi proovide välklambi puhastamisel, mis eemaldab proovilahustis soola- või puhverkomponendid, et hõlbustada proovi kasutamist järgmistes uuringutes. Selles postituses kasutati proovina tugeva polaarsusega hiilgavat sinist FCF -i ja puhastati C18AQ veerus. Proovilahusti asendati puhverlahuse orgaanilise lahustiga, hõlbustades sellega järgmist pöörlevat aurustumist, samuti säästmise ja tööaja säästmist. Lisaks parandati proovi puhtust, eemaldades valimis mõned lisandid.
Eksperimentaalne osa
Joonis 2. Proovi keemiline struktuur.
Selle postituse proovina kasutati säravat sinist FCF -i. Tooreproovi puhtus oli 86% ja proovi keemiline struktuur on näidatud joonisel 2. Proovilahuse valmistamiseks lahustati 300 mg pulbrilist toornainet särava sinise FCF -i tahke aine 1 M NAH2PO4 puhverlahuses ja raputas hästi, et saada täiesti selgeks lahenduseks. Seejärel süstiti proovilahus injektori abil välklambisse. Välituspuhastuse eksperimentaalne seadistus on loetletud tabelis 1.
| Instrument | Sepabean ™ masin2 | |||
| Padrunid | 12 g sepaflash C18 RP välkikassetti (sfääriline ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å, tellimisnumber: SW-5222-012-sp) | 12 g Sepaflash C18AQ RP välkikassetti (sfääriline ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å, tellimisnumber ： SW-5222-012-sp (AQ)） | ||
| Lainepikkus | 254 nm | |||
| Mobiilne etapp | Lahusti a ： vesi Lahusti b ： metanool | |||
| Voolukiirus | 30 ml/min | |||
| Proovi laadimine | 300 mg (hiilgav sinine FCF puhtusega 86%) | |||
| Gradient | Aeg (CV) | Lahusti B (%) | Aeg (CV) | Lahusti B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Tulemused ja arutelu
Proovide magestamiseks ja puhastamiseks kasutati Sepaflash C18AQ RP välkikassetti. Kasutati astme gradienti, milles kasutati elueerimise alguses liikuva faasina puhast vett ja kulges 10 kolonni köite (CV) jaoks. Nagu on näidatud joonisel 3, säilitati proov puhast vett liikuva faasina täielikult välkpunktil. Järgmisena suurendati liikuvas faasis metanool otse 100% -ni ja gradienti hoiti 7,5 cv. Proov elueeriti 11,5 -lt 13,5 CV -ni. Kogutud fraktsioonides asendati proovilahus NAH2PO4 puhverlahusest metanoolile. Võrreldes väga vesilahusega, oli metanooli palju lihtsam eemaldada järgnevas etapis pöörleva aurustumisega, mis hõlbustab järgmisi uuringuid.
Joonis 3. Proovi välklambi kromatogramm C18AQ kassetil.
C18AQ kasseti ja tavalise C18 kasseti peetumiskäitumise võrdlemiseks viidi läbi tugeva polaarsusega proovide jaoks paralleelne võrdluskatse. Kasutati Sepaflash C18 RP välkikassetti ja proovi flash -kromatogramm on näidatud joonisel 4. Regulaarsete C18 kassettide jaoks on kõrgeim talutav vesifaasi suhe umbes 90%. Seetõttu seati stardigradient 10% metanoolile 90% vees. Nagu on näidatud joonisel 4, hoiti proovi C18 ahelate hüdrofoobse faasi kokkuvarisemise tõttu tavalisel C18 kassetil vaevalt ja see elueeti otseselt liikuv faas. Selle tulemusel ei saa proovide magestamise või puhastamise toimimist lõpule viia.
Joonis 4. Proovi välklambi kromatogramm tavalisel C18 kassetil.
Võrreldes lineaarse gradiendiga, on Step Gradiendi kasutamisel järgmised eelised:
1. Proovi puhastamiseks on lahusti kasutamine ja tööaeg vähenenud.
2. Sihttoode elab teravas tipus, mis vähendab kogutud fraktsioonide mahtu ja hõlbustab seega järgmist pöörlevat aurustumist ja säästmist.
3. Kogutud toode on metanoolis, mida on lihtne aurustuda, seega väheneb kuivamisaeg.
Kokkuvõtteks võib tugevalt polaarse või väga hüdrofiilse proovi puhastamiseks Sepaflash C18AQ RP välkpuhastid, mis ühendaksid ettevalmistava välklambi kromatograafiasüsteemi Sepabean ™ masinaga kiire ja tõhusa lahenduse.
Umbes Sepaflash -seeria C18 RP välklambides
Seal on seeria Sepaflash C18AQ RP välkpunktid, millel on Santai tehnoloogia erinevad spetsifikatsioonid (nagu on näidatud tabelis 2).
| Üksuse number | Veerusuurus | Voolukiirus (ml/min) | Maksimaalne rõhk (PSI/BAR) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-sp (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-sp (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-sp (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-sp (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-sp (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabel 2. Sepaflash C18AQ RP välkpuhnad.
Pakkematerjalid: ülitõhusa sfäärilise C18 (AQ) lisatud ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å.
logy (nagu on näidatud tabelis 2).
Postiaeg: 27.-2018 august