Hongcheng Wang, Bo Xu
Rakenduste uurimis- ja arenduskeskus
Sissejuhatus
Statsionaarse faasi ja liikuva faasi suhtelise polaarsuse järgi võib vedelikkromatograafia jagada normaalfaasikromatograafiaks (NPC) ja pöördfaasikromatograafiaks (RPC).RPC puhul on liikuva faasi polaarsus tugevam kui statsionaarsel faasil.Tänu oma kõrgele efektiivsusele, heale eraldusvõimele ja selgele retentsioonimehhanismile on RPC-st saanud kõige laialdasemalt kasutatav vedelikkromatograafia eraldusrežiimides.Seetõttu sobib RPC erinevate polaarsete või mittepolaarsete ühendite, sealhulgas alkaloidide, süsivesikute, rasvhapete, steroidide, nukleiinhapete, aminohapete, peptiidide, valkude jne eraldamiseks ja puhastamiseks. RPC puhul on kõige sagedamini kasutatav statsionaarne faas. silikageeli maatriks, mis on seotud erinevate funktsionaalrühmadega, sealhulgas C18, C8, C4, fenüül, tsüano, amino jne. Nendest seotud funktsionaalrühmadest on kõige laialdasemalt kasutatav C18.Hinnanguliselt kasutab enam kui 80% RPC-dest nüüd C18 sidefaasi.Seetõttu on C18 kromatograafiakolonnist saanud iga labori kohustuslik universaalne kolonn.
Kuigi C18 kolonni saab kasutada väga paljudes rakendustes, võib mõnede väga polaarsete või väga hüdrofiilsete proovide puhul tavalistel C18 kolonnidel selliste proovide puhastamisel tekkida probleeme.RPC-s saab tavaliselt kasutatavad elueerimislahustid järjestada nende polaarsuse järgi: vesi < metanool < atsetonitriil < etanool < tetrahüdrofuraan < isopropanool.Nende proovide (tugevalt polaarse või väga hüdrofiilse) kolonnis hea püsivuse tagamiseks on vaja kasutada liikuva faasina suurt osa vesisüsteemi.Kui aga kasutate liikuva faasina puhast veesüsteemi (sh puhast vett või puhast soolalahust), kipub C18 kolonni statsionaarses faasis olev pikk süsinikuahel vett vältima ja omavahel segunema, mille tulemuseks on veesisalduse hetkeline vähenemine. kolonni retentsioonivõime või isegi selle puudumine.Seda nähtust nimetatakse "hüdrofoobse faasi kollapsiks" (nagu on näidatud joonise 1 vasakpoolses osas).Kuigi see olukord on pöörduv, kui kolonni pestakse orgaaniliste lahustitega, nagu metanool või atsetonitriil, võib see siiski kolonni kahjustada.Seetõttu on vaja seda olukorda vältida.
Joonis 1. Seotud faaside skemaatiline diagramm silikageeli pinnal tavalises C18 kolonnis (vasakul) ja C18AQ kolonnis (paremal).
Eespool nimetatud probleemide lahendamiseks on kromatograafiliste pakkematerjalide tootjad teinud tehnilisi täiustusi.Üks neist täiustustest on mõningate muudatuste tegemine ränidioksiidi maatriksi pinnal, näiteks hüdrofiilsete tsüanorühmade lisamine (nagu on näidatud joonise 1 parempoolses osas), et muuta silikageeli pind hüdrofiilsemaks.Seega saab ränidioksiidi pinnal olevaid C18 ahelaid kõrge vesikeskkonna tingimustes täielikult pikendada ja hüdrofoobse faasi kokkuvarisemist saab vältida.Neid modifitseeritud C18 kolonne nimetatakse vesipõhisteks C18 kolonnideks, nimelt C18AQ kolonnideks, mis on mõeldud kõrge vesilahusega elueerimistingimuste jaoks ja taluvad 100% vesisüsteemi.C18AQ kolonne on laialdaselt kasutatud tugevate polaarsete ühendite, sealhulgas orgaaniliste hapete, peptiidide, nukleosiidide ja veeslahustuvate vitamiinide eraldamisel ja puhastamisel.
Soola eemaldamine on C18AQ kolonnide üks tüüpilisi rakendusi proovide kiirpuhastamisel, mis eemaldab proovilahustist soola või puhvri komponendid, et hõlbustada proovi kasutamist järgmistes uuringutes.Selles postituses kasutati proovina tugeva polaarsusega Brilliant Blue FCF-i ja puhastati C18AQ kolonnis.Proovilahusti asendati puhverlahuse orgaanilise lahustiga, hõlbustades nii järgnevat rotaatoraurustamist ning säästes lahusteid ja tööaega.Lisaks parandati proovi puhtust, eemaldades proovist mõned lisandid.
Eksperimentaalne osa
Joonis 2. Proovi keemiline struktuur.
Selles postituses kasutati näidisena Brilliant Blue FCF-i.Toorproovi puhtus oli 86% ja proovi keemiline struktuur on näidatud joonisel 2. Proovilahuse valmistamiseks lahustati 1 M NaH2PO4 puhverlahuses 300 mg pulbrilist Brilliant Blue FCF tahket ainet ja loksutati korralikult, et saada. täiesti selge lahendus.Seejärel süstiti proovilahus injektori abil kiirkolonni.Kiirpuhastuse eksperimentaalne seadistus on loetletud tabelis 1.
| Instrument | SepaBean™ masin2 | |||
| Kassetid | 12 g SepaFlash C18 RP välgukassett (sfääriline ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å, Tellimisnumber: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP välklambi kassett (sfääriline ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å, tellimisnumber: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Lainepikkus | 254 nm | |||
| Mobiilne faas | Lahusti A: vesi Lahusti B: metanool | |||
| Voolukiirus | 30 ml/min | |||
| Proovi laadimine | 300 mg (Brilliant Blue FCF puhtusega 86%) | |||
| Gradient | Aeg (CV) | Lahusti B (%) | Aeg (CV) | Lahusti B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Tulemused ja arutlus
Proovide soola eemaldamiseks ja puhastamiseks kasutati SepaFlash C18AQ RP välklambi kassetti.Kasutati astmelist gradienti, milles elueerimise alguses kasutati liikuva faasina puhast vett ja kasutati 10 kolonni mahtu (CV).Nagu on näidatud joonisel fig 3, jäi proov puhta vee kasutamisel liikuva faasina täielikult välklambi kassetile.Järgmisena suurendati metanooli taset liikuvas faasis otse 100%-ni ja gradienti säilitati 7,5 CV.Proov elueeriti välja vahemikus 11,5 kuni 13,5 CV.Kogutud fraktsioonides asendati proovilahus NaH2PO4 puhverlahuselt metanooliga.Võrreldes tugeva vesilahusega oli metanooli palju lihtsam eemaldada järgmises etapis pöördaurustamisega, mis hõlbustab järgmist uurimistööd.
Joonis 3. Proovi kiirkromatogramm C18AQ kassetil.
C18AQ kasseti ja tavalise C18 kasseti peetumiskäitumise võrdlemiseks tugeva polaarsusega proovide puhul viidi läbi paralleelne võrdlustest.Kasutati SepaFlash C18 RP välkkassetti ja proovi välkkromatogramm on näidatud joonisel 4. Tavaliste C18 padrunite puhul on suurim talutav vesifaasi suhe umbes 90%.Seetõttu määrati alggradiendiks 10% metanooli 90% vees.Nagu on näidatud joonisel fig 4, püsis proov C18 ahelate hüdrofoobse faasi kollapsi tõttu, mis oli põhjustatud suurest veesuhtest, vaevu tavalisel C18 padrunil ja elueeriti liikuv faas otse välja.Selle tulemusena ei saa proovide soolamist või puhastamist lõpule viia.
Joonis 4. Proovi kiirkromatogramm tavalisel C18 padrunil.
Võrreldes lineaarse gradiendiga on astmelise gradiendi kasutamisel järgmised eelised:
1. Lahusti kasutamine ja proovi puhastamise tööaeg on vähenenud.
2. Sihtprodukt elueerub terava piigina, mis vähendab kogutud fraktsioonide mahtu ja hõlbustab seega järgnevat pöörlevat aurustumist ning säästab aega.
3. Kogutud saadus on metanoolis, mida on lihtne aurustada, mistõttu kuivamisaeg lüheneb.
Kokkuvõtteks võib öelda, et tugevalt polaarse või väga hüdrofiilse proovi puhastamiseks võivad SepaFlash C18AQ RP välklambikassetid koos preparatiivse kiirkromatograafiasüsteemiga SepaBean™ Machine pakkuda kiiret ja tõhusat lahendust.
Teave SepaFlash Bonded Series C18 RP välgukassettide kohta
Santai Technology eri spetsifikatsioonidega SepaFlash C18AQ RP-välklampide seeriat on saadaval (nagu on näidatud tabelis 2).
| Eseme number | Veeru suurus | Voolukiirus (ml/min) | Maksimaalne rõhk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabel 2. SepaFlash C18AQ RP välklambikassetid.
Pakkematerjalid: ülitõhus sfääriline C18(AQ)-seotud ränidioksiid, 20 - 45 μm, 100 Å.
loogika (nagu on näidatud tabelis 2).
Postitusaeg: Aug-27-2018