Hongcheng Wang, Bo Xu
Centro de I+D de aplicaciones
Introducción
Según las polaridades relativas de la fase estacionaria y la fase móvil, la cromatografía líquida se puede dividir en cromatografía de fase normal (NPC) y cromatografía de fase inversa (RPC).Para RPC, la polaridad de la fase móvil es más fuerte que la de la fase estacionaria.RPC se ha convertido en el más utilizado en los modos de separación de cromatografía líquida debido a su alta eficiencia, buena resolución y claro mecanismo de retención.Por lo tanto, RPC es adecuado para la separación y purificación de varios compuestos polares o no polares, incluidos alcaloides, carbohidratos, ácidos grasos, esteroides, ácidos nucleicos, aminoácidos, péptidos, proteínas, etc. En RPC, la fase estacionaria más utilizada es la matriz de gel de sílice que está enlazada con varios grupos funcionales, incluidos C18, C8, C4, fenilo, ciano, amino, etc. Entre estos grupos funcionales enlazados, el más utilizado es el C18.Se estima que más del 80% de los RPC ahora usan fase ligada C18.Por lo tanto, la columna de cromatografía C18 se ha convertido en una columna universal imprescindible para todos los laboratorios.
Aunque la columna C18 se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones, sin embargo, para algunas muestras que son muy polares o altamente hidrófilas, las columnas C18 normales pueden tener problemas cuando se utilizan para purificar dichas muestras.En RPC, los solventes de elución comúnmente utilizados se pueden ordenar según su polaridad: agua < metanol < acetonitrilo < etanol < tetrahidrofurano < isopropanol.Para asegurar una buena retención en la columna para estas muestras (fuertemente polares o altamente hidrofílicas), es necesario utilizar una alta proporción de sistema acuoso como fase móvil.Sin embargo, cuando se utiliza un sistema de agua pura (incluyendo agua pura o solución salina pura) como fase móvil, la larga cadena de carbono en la fase estacionaria de la columna C18 tiende a evitar el agua y se mezcla entre sí, lo que resulta en una disminución instantánea en la capacidad de retención de la columna o incluso sin retención.Este fenómeno se denomina “colapso de fase hidrofóbica” (como se muestra en la parte izquierda de la Figura 1).Aunque esta situación es reversible cuando la columna se lava con disolventes orgánicos como metanol o acetonitrilo, todavía puede dañar la columna.Por lo tanto, es necesario evitar que esta situación suceda.
Figura 1. El diagrama esquemático de las fases enlazadas en la superficie del gel de sílice en la columna C18 regular (izquierda) y la columna C18AQ (derecha).
Para abordar los problemas mencionados anteriormente, los fabricantes de materiales de relleno cromatográficos han realizado mejoras técnicas.Una de estas mejoras es realizar algunas modificaciones en la superficie de la matriz de sílice, como la introducción de grupos ciano hidrofílicos (como se muestra en la parte derecha de la Figura 1), para hacer que la superficie del gel de sílice sea más hidrofílica.Por lo tanto, las cadenas C18 en la superficie de sílice podrían extenderse completamente en condiciones altamente acuosas y podría evitarse el colapso de la fase hidrofóbica.Estas columnas C18 modificadas se denominan columnas C18 acuosas, es decir, columnas C18AQ, que están diseñadas para condiciones de elución altamente acuosas y pueden tolerar un sistema 100 % acuoso.Las columnas C18AQ se han aplicado ampliamente en la separación y purificación de compuestos polares fuertes, incluidos ácidos orgánicos, péptidos, nucleósidos y vitaminas solubles en agua.
La desalinización es una de las aplicaciones típicas de las columnas C18AQ en la purificación flash de muestras, que elimina la sal o los componentes tampón del disolvente de la muestra para facilitar la aplicación de la muestra en estudios posteriores.En esta publicación, se usó como muestra el azul brillante FCF con fuerte polaridad y se purificó en la columna C18AQ.El solvente de la muestra se reemplazó por solvente orgánico de la solución tampón, lo que facilitó la siguiente evaporación rotatoria, además de ahorrar solventes y tiempo de operación.Además, se mejoró la pureza de la muestra eliminando algunas impurezas de la muestra.
seccion experimental
Figura 2. La estructura química de la muestra.
El Brilliant Blue FCF se utilizó como muestra en esta publicación.La pureza de la muestra sin procesar fue del 86 % y la estructura química de la muestra se muestra en la Figura 2. Para preparar la solución de la muestra, se disolvieron 300 mg de sólido crudo en polvo de Brilliant Blue FCF en una solución tampón de NaH2PO4 1 M y se agitó bien para convertirla en una solución completamente clara.A continuación, la solución de muestra se inyectó en la columna flash mediante un inyector.La configuración experimental de la purificación flash se enumera en la Tabla 1.
| Instrumento | Máquina SepaBean™2 | |||
| Cartuchos | Cartucho flash SepaFlash C18 RP de 12 g (sílice esférica, 20 - 45 μm, 100 Å, número de pedido: SW-5222-012-SP) | Cartucho flash SepaFlash C18AQ RP de 12 g (sílice esférica, 20 - 45 μm, 100 Å, número de pedido: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Longitud de onda | 254nm | |||
| Fase móvil | Disolvente A: Agua Disolvente B: metanol | |||
| Tasa de flujo | 30 ml/min | |||
| Carga de muestras | 300 mg (Azul Brillante FCF con una pureza del 86%) | |||
| Degradado | Tiempo (CV) | Disolvente B (%) | Tiempo (CV) | Disolvente B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultados y discusión
Se utilizó un cartucho flash SepaFlash C18AQ RP para la desalinización y purificación de las muestras.Se utilizó un gradiente escalonado en el que se usó agua pura como fase móvil al comienzo de la elución y se procesó durante 10 volúmenes de columna (CV).Como se muestra en la Figura 3, cuando se usó agua pura como fase móvil, la muestra quedó completamente retenida en el cartucho flash.A continuación, se aumentó directamente el metanol en la fase móvil al 100% y se mantuvo el gradiente durante 7,5 CV.La muestra se eluyó de 11,5 a 13,5 CV.En las fracciones recolectadas, la solución de muestra se reemplazó de solución tampón de NaH2PO4 a metanol.En comparación con una solución altamente acuosa, el metanol fue mucho más fácil de eliminar por evaporación rotatoria en el paso posterior, lo que facilita la siguiente investigación.
Figura 3. El cromatograma flash de la muestra en un cartucho C18AQ.
Para comparar el comportamiento de retención del cartucho C18AQ y el cartucho C18 regular para muestras de fuerte polaridad, se realizó una prueba de comparación paralela.Se utilizó un cartucho flash SepaFlash C18 RP y el cromatograma flash para la muestra se muestra en la Figura 4. Para los cartuchos C18 normales, la proporción de fase acuosa más alta tolerada es de aproximadamente el 90 %.Por lo tanto, el gradiente inicial se fijó en 10 % de metanol en 90 % de agua.Como se muestra en la Figura 4, debido al colapso de la fase hidrofóbica de las cadenas C18 causado por una proporción acuosa alta, la muestra apenas se retuvo en el cartucho C18 regular y fue eluida directamente por la fase móvil.Como resultado, la operación de desalinización o purificación de la muestra no puede completarse.
Figura 4. El cromatograma flash de la muestra en un cartucho C18 normal.
En comparación con el gradiente lineal, el uso del gradiente escalonado tiene las siguientes ventajas:
1. Se reduce el uso de disolventes y el tiempo de ejecución para la purificación de muestras.
2. El producto objetivo eluye en un pico pronunciado, lo que reduce el volumen de las fracciones recolectadas y, por lo tanto, facilita la siguiente evaporación rotatoria y ahorra tiempo.
3. El producto recolectado está en metanol que es fácil de evaporar, por lo que se reduce el tiempo de secado.
En conclusión, para la purificación de la muestra que es fuertemente polar o altamente hidrofílica, los cartuchos flash SepaFlash C18AQ RP combinados con el sistema de cromatografía flash preparativa SepaBean™ Machine podrían ofrecer una solución rápida y eficiente.
Acerca de los cartuchos flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Hay una serie de cartuchos flash SepaFlash C18AQ RP con diferentes especificaciones de Santai Technology (como se muestra en la Tabla 2).
| Número de artículo | Tamaño de columna | Tasa de flujo (ml/min) | Presión máxima (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 gramos | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 gramos | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 gramos | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gramos | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 gramos | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 gramos | 40-80 | 250/17,2 |
Tabla 2. Cartuchos flash SepaFlash C18AQ RP.
Materiales de empaque: Sílice ligada con C18(AQ) esférica de alta eficiencia, 20 - 45 μm, 100 Å.
logía (como se muestra en la Tabla 2).
Hora de publicación: 27 de agosto de 2018