Hongcheng Wang, Bo Xu
Centro de I + D de la aplicación
Introducción
Según las polaridades relativas de la fase estacionaria y la fase móvil, la cromatografía líquida se puede dividir en cromatografía de fase normal (NPC) y cromatografía de fase invertida (RPC). Para RPC, la polaridad de la fase móvil es más fuerte que la de la fase estacionaria. RPC se ha convertido en el más utilizado en modos de separación de cromatografía líquida debido a su alta eficiencia, buena resolución y un claro mecanismo de retención. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, etc. Entre estos grupos funcionales unidos, el más utilizado es C18. Se estima que más del 80% de RPC ahora están usando la fase unida C18. Por lo tanto, la columna de cromatografía C18 se ha convertido en una columna universal imprescindible para cada laboratorio.
Sin embargo, aunque la columna C18 se puede usar en una amplia gama de aplicaciones, para algunas muestras que son muy polares o altamente hidrófilas, las columnas C18 regulares pueden tener problemas cuando se usan para purificar tales muestras. En RPC, los solventes de elución de uso común se pueden ordenar de acuerdo con su polaridad: agua <metanol <acetonitrilo <etanol <tetrahidrofurano <isopropanol. Para garantizar una buena retención en la columna para estas muestras (fuertes polares o altamente hidrofílicos), es necesario usar una alta proporción de sistema acuoso como fase móvil. Sin embargo, cuando se usa un sistema de agua pura (incluida el agua pura o la solución de sal pura) como fase móvil, la larga cadena de carbono en la fase estacionaria de la columna C18 tiende a evitar el agua y mezclarse entre sí, lo que resulta en una disminución instantánea en la capacidad de retención de la columna o incluso sin retención. Este fenómeno se llama "colapso de fase hidrofóbica" (como se muestra en la parte izquierda de la Figura 1). Aunque esta situación es reversible cuando la columna se lava con solventes orgánicos como metanol o acetonitrilo, aún puede causar daños en la columna. Por lo tanto, es necesario evitar que esta situación suceda.
Figura 1. El diagrama esquemático de las fases unidas en la superficie del gel de sílice en la columna C18 regular (izquierda) y la columna C18AQ (derecha).
Para abordar los problemas mencionados anteriormente, los fabricantes de materiales de embalaje cromatográfico han realizado mejoras técnicas. Una de estas mejoras es hacer algunas modificaciones en la superficie de la matriz de sílice, como la introducción de grupos ciano hidrofílicos (como se muestra en la parte derecha de la Figura 1), para hacer que la superficie del gel de sílice sea más hidrofílica. Por lo tanto, las cadenas C18 en la superficie de sílice podrían extenderse completamente en condiciones altamente acuosas y se podría evitar el colapso de fase hidrofóbica. Estas columnas C18 modificadas se llaman columnas acuosas C18, a saber, columnas C18AQ, que están diseñadas para condiciones de elución altamente acuosas y pueden tolerar un sistema acuoso 100%. Las columnas C18AQ se han aplicado ampliamente en la separación y purificación de compuestos polares fuertes, incluidos ácidos orgánicos, péptidos, nucleósidos y vitaminas solubles en agua.
La desalación es una de las aplicaciones típicas de las columnas C18AQ en la purificación flash para muestras, lo que elimina los componentes de sal o tampón en el solvente de muestra para facilitar la aplicación de la muestra en estudios posteriores. En esta publicación, el FCF azul brillante con una polaridad fuerte se usó como muestra y se purificó en la columna C18AQ. El disolvente de muestra fue reemplazado por un disolvente orgánico de la solución de tampón, lo que facilita la siguiente evaporación rotativa, así como el ahorro de solventes y el tiempo de funcionamiento. Además, la pureza de la muestra se mejoró al eliminar algunas impurezas en la muestra.
Sección experimental
Figura 2. La estructura química de la muestra.
El brillante FCF azul se usó como muestra en esta publicación. La pureza de la muestra cruda fue del 86% y la estructura química de la muestra se mostró en la Figura 2. Para preparar la solución de la muestra, se disolvió 300 mg de sólido crudo en polvo de FCF azul brillante en una solución de tampón NAH2PO4 1 M y se sacudió bien para convertirse en una solución completamente clara. La solución de muestra fue inyectada en la columna Flash por un inyector. La configuración experimental de la purificación flash se enumera en la Tabla 1.
| Instrumento | Máquina Sepabean ™2 | |||
| Cartuchos | 12 g de cartucho de flash SepaFlash C18 RP (sílice esférica, 20-45 μm, 100 Å, número de pedido: SW-5222-012-SP) | 12 g de cartucho flash RP SepaFlash C18AQ RP (sílice esférica, 20-45 μm, 100 Å, número de pedido: SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Longitud de onda | 254 nm | |||
| Fase móvil | Solvente A: agua Solvente B: metanol | |||
| Caudal | 30 ml/min | |||
| Carga de muestra | 300 mg (FCF azul brillante con la pureza del 86%) | |||
| Gradiente | Tiempo (CV) | Solvente B (%) | Tiempo (CV) | Solvente B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultados y discusión
Se usó un cartucho de flash SepaFlash C18AQ RP para la desalación y la purificación de la muestra. El gradiente de paso se utilizó en el que se usó agua pura como fase móvil al comienzo de la elución y se ejecutó para volúmenes de 10 columnas (CV). Como se muestra en la Figura 3, cuando se usa agua pura como fase móvil, la muestra se retuvo completamente en el cartucho flash. A continuación, el metanol en la fase móvil se incrementó directamente al 100% y el gradiente se mantuvo durante 7,5 cv. La muestra se eluyó de 11.5 a 13.5 cv. En las fracciones recolectadas, la solución de muestra se reemplazó desde la solución de tampón NAH2PO4 al metanol. En comparación con una solución altamente acuosa, el metanol fue mucho más fácil de eliminar por evaporación rotativa en el paso posterior, lo que facilita la siguiente investigación.
Figura 3. El cromatograma de flash de la muestra en un cartucho C18AQ.
Para comparar el comportamiento de retención del cartucho C18AQ y el cartucho C18 regular para muestras de polaridad fuerte, se realizó una prueba de comparación paralela. Se usó un cartucho de flash SepaFlash C18 RP y el cromatograma de flash para la muestra se mostró en la Figura 4. Para los cartuchos C18 regulares, la relación de fase acuosa tolerada más alta es de aproximadamente el 90%. Por lo tanto, el gradiente de inicio se estableció en 10% de metanol en 90% de agua. Como se muestra en la Figura 4, debido al colapso de la fase hidrofóbica de las cadenas C18 causadas por una alta relación acuosa, la muestra apenas se retuvo en el cartucho C18 regular y fue eludido directamente por la fase móvil. Como resultado, no se puede completar el funcionamiento de la desalación o la purificación de la muestra.
Figura 4. El cromatograma de flash de la muestra en un cartucho C18 normal.
En comparación con el gradiente lineal, el uso del gradiente de paso tiene las siguientes ventajas:
1. El uso del solvente y el tiempo de ejecución para la purificación de la muestra se reducen.
2. El producto objetivo se eluye en un pico agudo, que reduce el volumen de fracciones recolectadas y, por lo tanto, facilita la siguiente evaporación rotativa y de ahorro de tiempo.
3. El producto recolectado está en metanol, que es fácil de evaporar, por lo tanto, se reduce el tiempo de secado.
En conclusión, para la purificación de la muestra que es fuertemente polar o altamente hidrofílica, los cartuchos de flash RP SepaFlash C18AQ RP que se combinan con el sistema de cromatografía de flash preparado, la máquina Sepabean ™ podría ofrecer una solución rápida y eficiente.
Acerca de la serie SepaFlash Bonded C18 RP Flash Cartridges
Hay una serie de cartuchos de flash Sepaflash C18AQ RP con diferentes especificaciones de la tecnología Santai (como se muestra en la Tabla 2).
| Número de artículo | Tamaño de columna | Caudal (ML/min) | Max. Presión (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabla 2. SEPAFLASH C18AQ RP Flash Cartridges.
Materiales de embalaje: sílice esférica de alta eficiencia C18 (AQ), 20-45 μm, 100 Å.
Logy (como se muestra en la Tabla 2).
Tiempo de publicación: agosto-27-2018