Hongcheng Wang, Bo Xu
Aplika R & D -Centro
Enkonduko
Laŭ la relativaj polusoj de senmova fazo kaj movebla fazo, likva kromatografio povas esti dividita en normalan fazan kromatografion (NPC) kaj inversigita fazo -kromatografio (RPC). Por RPC, la polaridad de la movebla fazo estas pli forta ol tiu de la senmova fazo. RPC fariĝis la plej vaste uzata en likva kromatografia apartiga reĝimo pro ĝia alta efikeco, bona rezolucio kaj klara reten -mekanismo. Tial RPC taŭgas por disiĝo kaj purigado de diversaj polusaj aŭ nepolusaj komponaĵoj, inkluzive de alkaloidoj, karbonhidratoj, grasaj acidoj, steroidoj, nukleaj acidoj, aminoacidoj, peptidoj, proteinoj, ktp. Amino, ktp. Inter ĉi tiuj ligitaj funkciaj grupoj, la plej vaste uzata estas C18. Oni taksas, ke pli ol 80% de RPC nun uzas C18 -ligitan fazon. Tial C18-kromatografia kolumno fariĝis nepra universala kolumno por ĉiu laboratorio.
Kvankam C18 -kolumno povas esti uzata en tre vasta gamo de aplikoj, tamen por iuj specimenoj, kiuj estas tre polusaj aŭ tre hidrofilaj, regulaj C18 -kolumnoj povas havi problemojn kiam ili estas uzataj por purigi tiajn specimenojn. En RPC, la ofte uzataj eluaj solviloj povas esti ordigitaj laŭ sia polareco: akvo <metanolo <acetonitrilo <etanolo <tetrahidrofuran <isopropanol. Por certigi bonan retenadon sur la kolumno por ĉi tiuj specimenoj (forta polusa aŭ tre hidrofila), necesas alta proporcio de akva sistemo por esti uzata kiel la movebla fazo. Tamen, kiam vi uzas puran akvan sistemon (inkluzive de pura akvo aŭ pura sala solvo) kiel la moveblan fazon, la longa karbona ĉeno sur la stacia fazo de C18 -kolumno emas eviti la akvon kaj miksi unu kun la alia, rezultigante tujan malpliiĝon de la retenkapacito de la kolumno aŭ eĉ neniu reteno. Ĉi tiu fenomeno estas nomata "hidrofoba fazo -kolapso" (kiel montras la maldekstra parto de Figuro 1). Kvankam ĉi tiu situacio estas revertebla kiam la kolumno estas lavita per organikaj solviloj kiel metanolo aŭ acetonitrilo, ĝi tamen povas kaŭzi damaĝon al la kolumno. Tial necesas malhelpi ĉi tiun situacion.
Figuro 1. La skema diagramo de la ligitaj fazoj sur la surfaco de silika ĝelo en regula C18 -kolumno (maldekstre) kaj C18AQ -kolumno (dekstre).
Por trakti la supre menciitajn problemojn, la fabrikantoj de kromatografiaj pakaj materialoj faris teknikajn plibonigojn. Unu el ĉi tiuj plibonigoj estas fari iujn modifojn sur la surfaco de la silika matrico, kiel la enkonduko de hidrofilaj ciano -grupoj (kiel montras la dekstra parto de Figuro 1), por fari la surfacon de la silica ĝelo pli hidrofila. Tiel la C18 -ĉenoj sur la silica surfaco povus esti plene etenditaj en tre akvaj kondiĉoj kaj la hidrofoba fazo -kolapso povus esti evitita. Ĉi tiuj modifitaj C18 -kolumnoj estas nomataj akvaj C18 -kolumnoj, nome C18AQ -kolumnoj, kiuj estas desegnitaj por tre akvaj eluciaj kondiĉoj kaj povas toleri 100% akvan sistemon. C18AQ-kolumnoj estis vaste aplikataj en la disiĝo kaj purigado de fortaj polusaj komponaĵoj, inkluzive de organikaj acidoj, peptidoj, nukleosidoj kaj akvorezistaj vitaminoj.
Desalting estas unu el la tipaj aplikoj de C18AQ -kolumnoj en la Flash -purigo por specimenoj, kiu forigas la salon aŭ bufro -komponentojn en la ekzempla solvilo por faciligi la aplikon de la specimeno en postaj studoj. En ĉi tiu poŝto, la brila blua FCF kun forta polareco estis uzata kiel la specimeno kaj purigita sur la kolumno C18AQ. La ekzempla solvilo estis anstataŭigita per organika solvilo el bufra solvo, tiel faciligante la sekvan rotacian vaporiĝon same kiel ŝparadon de solviloj kaj operacia tempo. Plue, la pureco de la specimeno estis plibonigita forigante iujn malpuraĵojn en la specimeno.
Eksperimenta Sekcio
Figuro 2. La kemia strukturo de la specimeno.
La brila blua FCF estis uzata kiel la specimeno en ĉi tiu afiŝo. La pureco de la kruda specimeno estis 86% kaj la kemia strukturo de la specimeno estis montrita en Figuro 2. Por prepari la specimenan solvon, 300 mg pulvora kruda solido de brila blua FCF dissolviĝis en 1 M NAH2PO4 -bufra solvo kaj skuis bone por fariĝi tute klara solvo. La ekzempla solvo tiam estis injektita en la ekbrilan kolumnon per injektilo. La eksperimenta aranĝo de la Flash -purigo estas listigita en la Tabelo 1.
| Instrumento | SepAbean ™ Maŝino2 | |||
| Kartoĉoj | 12 G Sepaflash C18 RP Flash-kartoĉo (sfera siliko, 20-45 μm, 100 Å, ordo-numero: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP Flash-kartoĉo (sfera siliko, 20-45 μm, 100 Å, ordo-nombro ： SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Ondolongo | 254 Nm | |||
| Poŝtelefona Fazo | Solva A ： Akvo Solva B ： Metanolo | |||
| Fluokvanto | 30 ml/min | |||
| Specimeno ŝarĝante | 300 mg (brila blua FCF kun la pureco de 86%) | |||
| Gradiento | Tempo (CV) | Solvilo B (%) | Tempo (CV) | Solvilo B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultoj kaj Diskuto
Seplaflash C18AQ RP Flash -kartoĉo estis uzita por specimeno desalting kaj purigo. Paŝa gradiento estis utiligita en kiu pura akvo estis uzata kiel la movebla fazo ĉe la komenco de eluo kaj funkcianta por 10 kolumnaj volumoj (CV). Kiel montrite en Figuro 3, kiam vi uzas puran akvon kiel la moveblan fazon, la specimeno estis tute konservita sur la fulmkartoĉo. Tuj poste, la metanolo en la movebla fazo estis rekte pliigita al 100% kaj la gradiento estis konservita por 7,5 cv. La specimeno eligis el 11,5 ĝis 13,5 cv. En la kolektitaj frakcioj, la ekzempla solvo estis anstataŭigita de NaH2PO4 -bufra solvo al metanolo. Komparante kun tre akva solvo, metanolo estis multe pli facile forigita per rotacia vaporiĝo en la posta paŝo, kio faciligas la sekvan esploradon.
Figuro 3. La ekbrila kromatogramo de la specimeno sur C18AQ -kartoĉo.
Por kompari la retenan konduton de C18AQ -kartoĉo kaj regula C18 -kartoĉo por specimenoj de forta polareco, paralela komparo -testo estis farita. Apartia C18 RP Flash -kartoĉo estis uzata kaj la fulmokromatogramo por la specimeno estis montrita en Figuro 4. Por regulaj C18 -kartoĉoj, la plej alta tolerita akva fazo -proporcio estas ĉirkaŭ 90%. Tial la komenca gradiento estis fiksita al 10% metanolo en 90% akvo. Kiel montrite en Figuro 4, pro la hidrofoba fazo -kolapso de la C18 -ĉenoj kaŭzitaj de alta akva rilatumo, la specimeno apenaŭ konserviĝis sur la regula C18 -kartoĉo kaj estis rekte eluzita de la movebla fazo. Rezulte, la funkciado de specimeno de desaltado aŭ purigo ne povas esti finita.
Figuro 4. La ekbrila kromatogramo de la specimeno sur regula C18 -kartoĉo.
Komparante kun lineara gradiento, la uzo de paŝa gradiento havas la jenajn avantaĝojn:
1. Solva uzado kaj daŭra tempo por specimeno purigo estas reduktita.
2. La cela produkto eluzas en akra pinto, kiu reduktas la volumon de kolektitaj frakcioj kaj tiel faciligas la sekvan rotacian vaporiĝon kaj ankaŭ ŝparas tempon.
3. La kolektita produkto estas en metanolo, kiu estas facile forvaporiĝinta, tiel sekiga tempo estas reduktita.
Konklude, por la purigado de la specimeno, kiu estas forte polusa aŭ tre hidrofila, sepaflash C18AQ RP Flash -kartoĉoj kombinantaj kun la prepara ekbrila kromatografia sistemo SepABean ™ -lo povus oferti rapidan kaj efikan solvon.
Pri la Seaflash Bonded Series C18 RP Flash -kartoĉoj
Ekzistas serio de la Flash -kartoĉoj de Seaflash C18AQ RP kun malsamaj specifoj de Santai -teknologio (kiel montrite en Tabelo 2).
| Item Numero | Kolumna grandeco | Fluokvanto (ml/min) | Max.pressure (PSI/Trinkejo) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5.4 G | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 G | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabelo 2. Sepaflash C18AQ RP Flash -kartoĉoj.
Pakaj Materialoj: Alt-efika sfera C18 (AQ) -Bondita siliko, 20-45 μm, 100 Å.
Logy (kiel montrite en Tabelo 2).
Afiŝotempo: aŭgusto-27-2018