Hongcheng Wang, Bo Xu
Aplika R&D-Centro
Enkonduko
Laŭ la relativaj polusoj de senmova fazo kaj movebla fazo, likva kromatografio povas esti dividita en normalfazan kromatografion (NPC) kaj inversan fazan kromatografion (RPC).Por RPC, la poluseco de la mova fazo estas pli forta ol tiu de la senmova fazo.RPC fariĝis la plej vaste uzata en likva kromatografia apartigreĝimoj pro sia alta efikeco, bona rezolucio kaj klara retenmekanismo.Tial RPC taŭgas por la apartigo kaj purigo de diversaj polusaj aŭ nepolusaj komponaĵoj, inkluzive de alkaloidoj, karbonhidratoj, grasacidoj, steroidoj, nukleaj acidoj, aminoacidoj, peptidoj, proteinoj, ktp. En RPC, la plej ofte uzata senmova fazo estas la silika ĝela matrico, kiu estas kunligita kun diversaj funkciaj grupoj, inkluzive de C18, C8, C4, fenilo, ciano, amino, ktp. Inter ĉi tiuj ligitaj funkciaj grupoj, la plej vaste uzata estas C18.Oni taksas, ke pli ol 80% de RPC nun uzas C18 ligitan fazon.Tial C18-kromatografiokolono fariĝis nepre necesa universala kolumno por ĉiu laboratorio.
Kvankam C18-kolumno povas esti uzita en tre larĝa gamo de aplikoj, aliflanke, por kelkaj provaĵoj kiuj estas tre polusaj aŭ tre hidrofilaj, regulaj C18-kolumnoj povas havi problemojn dum estado uzitaj por purigi tiajn provaĵojn.En RPC, la ofte uzataj solvaĵoj povas esti ordonitaj laŭ sia poluseco: akvo < metanolo < acetonitrilo < etanolo < tetrahidrofurano < izopropanolo.Por certigi bonan retenon sur la kolono por tiuj provaĵoj (fortaj polusaj aŭ tre hidrofilaj), alta proporcio de akva sistemo estas necesa por esti utiligita kiel la mova fazo.Tamen, kiam oni uzas puran akvosistemon (inkluzive de pura akvo aŭ pura sala solvo) kiel la moveblan fazon, la longa karbonĉeno sur la senmova fazo de C18-kolumno emas eviti la akvon kaj miksi unu kun la alia, rezultigante tujan malkreskon de la retenkapablo de la kolono aŭ eĉ neniu reteno.Ĉi tiu fenomeno nomiĝas "hidrofoba fazokolapso" (kiel montrite en la maldekstra parto de Figuro 1).Kvankam ĉi tiu situacio estas reigebla kiam la kolono estas lavita per organikaj solviloj kiel metanolo aŭ acetonitrilo, ĝi ankoraŭ povas kaŭzi damaĝon al la kolono.Tial necesas malhelpi ĉi tiun situacion okazi.
Figuro 1. La skema diagramo de la kunligitaj fazoj sur la surfaco de silica ĝelo en regula C18-kolumno (maldekstre) kaj C18AQ-kolumno (dekstre).
Por trakti la supre menciitajn problemojn, la fabrikantoj de kromatografiaj pakmaterialoj faris teknikajn plibonigojn.Unu el ĉi tiuj plibonigoj faras kelkajn modifojn sur la surfaco de la silika matrico, kiel ekzemple la enkonduko de hidrofilaj cianogrupoj (kiel montrite en la dekstra parto de Figuro 1), por igi la surfacon de la silika ĝelo pli hidrofila.Tiel la C18-ĉenoj sur la silicoksidsurfaco povus esti plene etenditaj sub tre akvaj kondiĉoj kaj la hidrofoba fazkolapso povus esti evitita.Tiuj modifitaj C18-kolumnoj estas nomitaj akvaj C18-kolumnoj, nome C18AQ-kolumnoj, kiuj estas dizajnitaj por tre akvaj eluciaj kondiĉoj kaj povas toleri 100% akvan sistemon.C18AQ-kolumnoj estis vaste aplikitaj en la apartigo kaj purigo de fortaj polusaj komponaĵoj, inkluzive de organikaj acidoj, peptidoj, nukleozidoj kaj hidrosolveblaj vitaminoj.
Sensaligado estas unu el la tipaj aplikoj de C18AQ-kolumnoj en la fulmpurigo por provaĵoj, kiu forigas la salon aŭ bufrokomponentojn en la provaĵosolvento por faciligi la aplikon de la provaĵo en postaj studoj.En ĉi tiu afiŝo, la Brila Blua FCF kun forta poluseco estis uzata kiel specimeno kaj purigita sur la kolumno C18AQ.La specimena solvilo estis anstataŭigita per organika solvilo de bufrosolvo, tiel faciligante la sekvan rotacian vaporiĝon same kiel ŝparante solvilojn kaj funkciantan tempon.Krome, la pureco de la provaĵo estis plibonigita forigante kelkajn malpuraĵojn en la provaĵo.
Eksperimenta Sekcio
Figuro 2. La kemia strukturo de la specimeno.
La Brila Blua FCF estis uzata kiel specimeno en ĉi tiu afiŝo.La pureco de la kruda specimeno estis 86% kaj la kemia strukturo de la specimeno estis montrita en Figuro 2. Por prepari la specimenan solvon, 300 mg pulvora kruda solido de Brilliant Blue FCF estis solvita en 1 M NaH2PO4-bufrsolvo kaj bone skuiĝis por fariĝi. tute klara solvo.La provaĵosolvo tiam estis injektita en la fulmkolonon per injekciilo.La eksperimenta aranĝo de la fulmpurigo estas listigita en la Tabelo 1.
| Instrumento | SepaBean™ Maŝino2 | |||
| Kartoĉoj | 12 g SepaFlash C18 RP-fulmkartoĉo (sfera silicoksido, 20 - 45 μm, 100 Å, Ordonumero: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP-fulmkartoĉo (sfera silicoksido, 20 - 45 μm, 100 Å, mendonumero: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Ondolongo | 254 nm | |||
| Movebla fazo | Solvento A: Akvo Solvento B: metanolo | |||
| Flukvanto | 30 ml/min | |||
| Ekzempla ŝarĝo | 300 mg (Brila Blua FCF kun la pureco de 86%) | |||
| Gradiento | Tempo (CV) | Solvento B (%) | Tempo (CV) | Solvento B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultoj kaj diskuto
SepaFlash C18AQ RP-fulmkartoĉo estis uzita por prova sensaligado kaj purigo.Paŝa gradiento estis utiligita en kiu pura akvo estis utiligita kiel la mova fazo ĉe la komenco de elucio kaj kurita por 10 kolumnovolumoj (CV).Kiel montrite en Figuro 3, uzante puran akvon kiel la moveblan fazon, la provaĵo estis tute retenita sur la fulmkartoĉo.Poste, la metanolo en la movebla fazo estis rekte pliigita al 100% kaj la gradiento estis konservita por 7.5 CV.La specimeno estis eluzita de 11.5 ĝis 13.5 CV.En la kolektitaj frakcioj, la provaĵsolvaĵo estis anstataŭigita de NaH2PO4 bufrosolvo al metanolo.Komparante kun tre akva solvaĵo, metanolo estis multe pli facile esti forigita per rotacia vaporiĝo en la posta paŝo, kiu faciligas la sekvan esploradon.
Figuro 3. La fulm-kromatogramo de la provaĵo sur C18AQ-kartoĉo.
Por kompari la retenkonduton de C18AQ-kartoĉo kaj regula C18-kartoĉo por specimenoj de forta poluseco, paralela kompara testo estis farita.SepaFlash C18 RP-fulmkartoĉo estis uzita kaj la fulmkromatogramo por la provaĵo estis montrita en Figuro 4. Por regulaj C18-kartoĉoj, la plej alta tolerita akva fazproporcio estas proksimume 90%.Tial la startgradiento estis fiksita je 10% metanolo en 90% akvo.Kiel montrite en Figuro 4, pro la hidrofoba fazkolapso de la C18-ĉenoj kaŭzita de alta akva proporcio, la provaĵo estis apenaŭ retenita sur la regula C18-kartoĉo kaj estis rekte eligita per la movebla fazo.Kiel rezulto, la operacio de specimena sensaligado aŭ purigado ne povas esti kompletigita.
Figuro 4. La fulm-kromatogramo de la specimeno sur regula C18-kartoĉo.
Komparante kun lineara gradiento, la uzo de paŝogradiento havas la sekvajn avantaĝojn:
1. Solventa uzado kaj rultempo por specimena purigo estas reduktitaj.
2. La cela produkto elutas en akra pinto, kiu reduktas la volumon de kolektitaj frakcioj kaj tiel faciligas la sekvan rotacian vaporiĝon kaj ŝparas tempon.
3. La kolektita produkto estas en metanolo, kiu estas facile vaporebla, tiel sekiga tempo estas reduktita.
Konklude, por la purigado de la specimeno, kiu estas forte polusa aŭ tre hidrofila, SepaFlash C18AQ RP-fulmaj kartoĉoj kombinantaj kun la prepara fulm-kromatografiosistemo SepaBean™ Machine povus proponi rapidan kaj efikan solvon.
Pri la SepaFlash Bonded Series C18 RP-fulmaj kartoĉoj
Estas serio de la SepaFlash C18AQ RP-fulmkartoĉoj kun malsamaj specifoj de Santai Technology (kiel montrite en Tabelo 2).
| Item Nombro | Kolumna Grandeco | Fluo-Indico (ml/min) | Maksimuma.Premo (psi/trinkejo) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tablo 2. SepaFlash C18AQ RP-flash-kartoĉoj.
Pakaĵmaterialoj: Alt-efikeca sfera C18(AQ)-ligita siliko, 20 - 45 μm, 100 Å.
logy (kiel montrite en Tabelo 2).
Afiŝtempo: Aŭg-27-2018