Rui Huang, Bo Xu
Κέντρο Ε&Α εφαρμογών
Εισαγωγή
Ένα πεπτίδιο είναι μια ένωση που αποτελείται από αμινοξέα, καθένα από τα οποία έχει μοναδικές φυσικές και χημικές ιδιότητες λόγω των διαφορετικών τύπων και σειράς υπολειμμάτων αμινοξέων που αποτελούν την αλληλουχία του.Με την ανάπτυξη της χημικής σύνθεσης στερεάς φάσης, η χημική σύνθεση διαφόρων ενεργών πεπτιδίων έχει σημειώσει μεγάλη πρόοδο.Ωστόσο, λόγω της περίπλοκης σύνθεσης του πεπτιδίου που λαμβάνεται με σύνθεση στερεάς φάσης, το τελικό προϊόν θα πρέπει να καθαρίζεται με αξιόπιστες μεθόδους διαχωρισμού.Οι συνήθως χρησιμοποιούμενες μέθοδοι καθαρισμού για πεπτίδια περιλαμβάνουν τη χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων (IEC) και την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC), οι οποίες έχουν τα μειονεκτήματα της χαμηλής ικανότητας φόρτωσης δείγματος, του υψηλού κόστους των μέσων διαχωρισμού, του περίπλοκου και δαπανηρού εξοπλισμού διαχωρισμού. κ.λπ. Για τον γρήγορο καθαρισμό πεπτιδίων μικρών μορίων (MW < 1 kDa), είχε δημοσιευτεί προηγουμένως μια επιτυχημένη περίπτωση εφαρμογής από την Santai Technologies, στην οποία χρησιμοποιήθηκε ένα φυσίγγιο SepaFlash RP C18 για τον γρήγορο καθαρισμό της θυμοπεντίνης (TP-5) και του λήφθηκε το προϊόν-στόχος που πληροί τις απαιτήσεις.
Εικόνα 1. 20 κοινά αμινοξέα (αναπαράγεται από το www.bachem.com).
Υπάρχουν 20 είδη αμινοξέων που είναι κοινά στη σύνθεση των πεπτιδίων.Αυτά τα αμινοξέα μπορούν να χωριστούν στις ακόλουθες ομάδες ανάλογα με την πολικότητα και την οξεοβασική τους ιδιότητα: μη πολικά (υδρόφοβα), πολικά (αφορτισμένα), όξινα ή βασικά (όπως φαίνεται στο Σχήμα 1).Σε μια πεπτιδική αλληλουχία, εάν τα αμινοξέα που αποτελούν την αλληλουχία είναι ως επί το πλείστον πολικά (όπως σημειώνονται με ροζ χρώμα στο σχήμα 1), όπως κυστεΐνη, γλουταμίνη, ασπαραγίνη, σερίνη, θρεονίνη, τυροσίνη κ.λπ., τότε αυτό το πεπτίδιο μπορεί να έχει ισχυρό πολικότητα και είναι εξαιρετικά διαλυτό στο νερό.Κατά τη διαδικασία καθαρισμού αυτών των δειγμάτων ισχυρών πολικών πεπτιδίων με χρωματογραφία ανάστροφης φάσης, θα συμβεί ένα φαινόμενο που ονομάζεται κατάρρευση υδρόφοβης φάσης (ανατρέξτε σε μια προηγουμένως δημοσιευμένη σημείωση εφαρμογής από την Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).Σε σύγκριση με τις κανονικές στήλες C18, οι βελτιωμένες στήλες C18AQ είναι οι πλέον κατάλληλες για τον καθαρισμό ισχυρών πολικών ή υδρόφιλων δειγμάτων.Σε αυτή τη θέση, ένα ισχυρό πολικό πεπτίδιο χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα και καθαρίστηκε από μια στήλη C18AQ.Ως αποτέλεσμα, ελήφθη το προϊόν-στόχος που πληροί τις απαιτήσεις και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην ακόλουθη έρευνα και ανάπτυξη.
| Οργανο | SepaBean™μηχανή 2 | |||
| Φυσίγγια | Κασέτα flash SepaFlash C18 RP 12 g (σφαιρικό πυρίτιο, 20 - 45 μm, 100 Å, αριθμός παραγγελίας: SW-5222-012-SP) | Κασέτα φλας 12 g SepaFlash C18AQ RP (σφαιρικό πυρίτιο, 20 - 45 μm, 100 Å, αριθμός παραγγελίας：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Μήκος κύματος | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Κινητή φάση | Διαλύτης Α: Νερό Διαλύτης Β: Ακετονιτρίλιο | |||
| Ρυθμός ροής | 15 mL/min | 20 mL/min | ||
| Φόρτωση δείγματος | 30 mg | |||
| Βαθμίδα | Χρόνος (Βιογραφικό) | Διαλύτης Β (%) | Χρόνος (λεπτά) | Διαλύτης Β (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Αποτελέσματα και συζήτηση
Για να συγκρίνουμε την απόδοση καθαρισμού για το δείγμα πολικού πεπτιδίου μεταξύ της κανονικής στήλης C18 και της στήλης C18AQ, χρησιμοποιήσαμε μια κανονική στήλη C18 για τον καθαρισμό flash του δείγματος ως αρχή.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, λόγω της κατάρρευσης της υδρόφοβης φάσης των αλυσίδων C18 που προκαλείται από την υψηλή υδατική αναλογία, το δείγμα μόλις συγκρατήθηκε στο κανονικό φυσίγγιο C18 και εκλούστηκε απευθείας από την κινητή φάση.Ως αποτέλεσμα, το δείγμα δεν διαχωρίστηκε αποτελεσματικά και δεν καθαρίστηκε.
Εικόνα 2. Το χρωματογράφημα flash του δείγματος σε κανονικό φυσίγγιο C18.
Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε μια στήλη C18AQ για τον καθαρισμό flash του δείγματος.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, το πεπτίδιο διατηρήθηκε αποτελεσματικά στη στήλη και στη συνέχεια εκλούστηκε.Το προϊόν στόχος διαχωρίστηκε από τις ακαθαρσίες στο ακατέργαστο δείγμα και συλλέχθηκε.Μετά τη λυοφιλοποίηση και στη συνέχεια την ανάλυση με HPLC, το καθαρισμένο προϊόν έχει καθαρότητα 98,2% και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί περαιτέρω για την έρευνα και την ανάπτυξη του επόμενου σταδίου.
Εικόνα 3. Το χρωματογράφημα flash του δείγματος σε φυσίγγιο C18AQ.
Συμπερασματικά, το φυσίγγιο φλας SepaFlash C18AQ RP σε συνδυασμό με το σύστημα χρωματογραφίας flash SepaBean™μηχανή θα μπορούσε να προσφέρει μια γρήγορη και αποτελεσματική λύση για τον καθαρισμό ισχυρών πολικών ή υδρόφιλων δειγμάτων.
Υπάρχει μια σειρά από δοχεία φλας SepaFlash C18AQ RP με διαφορετικές προδιαγραφές από την τεχνολογία Santai (όπως φαίνεται στον Πίνακα 2).
| Αριθμός αντικειμένου | Μέγεθος στήλης | Ρυθμός ροής (mL/min) | Μέγιστη πίεση (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 γρ | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 γρ | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 γρ | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 γρ | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 γρ | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 γρ | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 γρ | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 γρ | 40-80 | 250/17.2 |
Πίνακας 2. Κασέτες φλας SepaFlash C18AQ RP.Υλικά συσκευασίας: Σφαιρικό πυρίτιο υψηλής απόδοσης C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις λεπτομερείς προδιαγραφές της μηχανής SepaBean™ ή τις πληροφορίες παραγγελίας για τις κασέτες φλας της σειράς SepaFlash, επισκεφθείτε την ιστοσελίδα μας.
Ώρα δημοσίευσης: Οκτ-12-2018