Hongcheng Wang, Bo Xu
Κέντρο Ε & Α της Εφαρμογής
Εισαγωγή
Σύμφωνα με τις σχετικές πολικότητες της στατικής φάσης και της κινητής φάσης, η υγρή χρωματογραφία μπορεί να χωριστεί σε χρωματογραφία φυσιολογικής φάσης (NPC) και αντιστρεπτή χρωματογραφία φάσης (RPC). Για το RPC, η πολικότητα της κινητής φάσης είναι ισχυρότερη από αυτή της στατικής φάσης. Το RPC έχει γίνει το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο σε τρόπους διαχωρισμού υγρής χρωματογραφίας λόγω της υψηλής απόδοσης, της καλής ανάλυσης και του καθαρού μηχανισμού συγκράτησης. Επομένως, το RPC είναι κατάλληλο για τον διαχωρισμό και τον καθαρισμό διαφόρων πολικών ή μη πολικών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων των αλκαλοειδών, των υδατανθράκων, των λιπαρών οξέων, των στεροειδών, των νουκλεϊνικών οξέων, των αμινοξέων, των πεπτιδίων, των πρωτεϊνών κλπ. Αυτές οι δεσμευμένες λειτουργικές ομάδες, το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο είναι C18. Εκτιμάται ότι περισσότερο από το 80% του RPC χρησιμοποιούν τώρα τη φάση C18. Ως εκ τούτου, η στήλη χρωματογραφίας C18 έχει γίνει μια καθολική στήλη που πρέπει να έχει για κάθε εργαστήριο.
Παρόλο που η στήλη C18 μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ένα πολύ ευρύ φάσμα εφαρμογών, ωστόσο, για ορισμένα δείγματα που είναι πολύ πολικά ή πολύ υδρόφιλα, οι κανονικές στήλες C18 μπορεί να έχουν προβλήματα όταν χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό τέτοιων δειγμάτων. Στο RPC, οι συνηθισμένοι διαλύτες έκλουσης μπορούν να παραγγελθούν σύμφωνα με την πολικότητα τους: νερό <μεθανόλη <ακετονιτριλίου <αιθανόλη <τετραϋδροφουρανίου <ισοπροπανόλη. Για να εξασφαλιστεί η καλή διατήρηση στη στήλη για αυτά τα δείγματα (ισχυρή πολική ή εξαιρετικά υδρόφιλη), είναι απαραίτητο το υψηλό ποσοστό υδατικού συστήματος για να χρησιμοποιηθεί ως κινητής φάση. Ωστόσο, όταν χρησιμοποιείτε σύστημα καθαρού νερού (συμπεριλαμβανομένου του καθαρού νερού ή του διαλύματος καθαρού αλατιού) ως κινητής φάσεων, η μακρά αλυσίδα άνθρακα στη στατική φάση της στήλης C18 τείνει να αποφεύγει το νερό και να αναμιγνύεται μεταξύ τους, με αποτέλεσμα μια στιγμιαία μείωση της ικανότητας συγκράτησης της στήλης ή ακόμα και χωρίς συγκράτηση. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται «κατάρρευση υδρόφοβης φάσης» (όπως φαίνεται στο αριστερό τμήμα του Σχήματος 1). Αν και αυτή η κατάσταση είναι αναστρέψιμη όταν η στήλη πλένεται με οργανικούς διαλύτες όπως η μεθανόλη ή το ακετονιτρίλιο, μπορεί να προκαλέσει βλάβη στη στήλη. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να αποφευχθεί η κατάσταση αυτής της κατάστασης.
Εικόνα 1. Το σχηματικό διάγραμμα των δεσμευμένων φάσεων στην επιφάνεια του πυριτικού πηκτώματος σε κανονική στήλη C18 (αριστερά) και C18AQ στήλη (δεξιά).
Για την αντιμετώπιση των προαναφερθέντων προβλημάτων, οι κατασκευαστές χρωματογραφικών υλικών συσκευασίας έχουν κάνει τεχνικές βελτιώσεις. Μία από αυτές τις βελτιώσεις είναι η πραγματοποίηση ορισμένων τροποποιήσεων στην επιφάνεια της πλέγματος πυριτίας, όπως η εισαγωγή υδρόφιλων κυανικών ομάδων (όπως φαίνεται στο δεξί μέρος του Σχήματος 1), για να καταστεί η επιφάνεια του πυριτικού πηκτή πιο υδρόφιλη. Έτσι, οι αλυσίδες C18 στην επιφάνεια του πυριτίου θα μπορούσαν να επεκταθούν πλήρως υπό εξαιρετικά υδατικές συνθήκες και η κατάρρευση της υδρόφοβης φάσης θα μπορούσε να αποφευχθεί. Αυτές οι τροποποιημένες στήλες C18 ονομάζονται υδατικές στήλες C18, δηλαδή στήλες C18AQ, οι οποίες έχουν σχεδιαστεί για εξαιρετικά υδατικές συνθήκες έκλουσης και μπορούν να ανεχθούν 100% υδατικό σύστημα. Οι στήλες C18AQ έχουν εφαρμοστεί ευρέως στον διαχωρισμό και τον καθαρισμό των ισχυρών πολικών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων των οργανικών οξέων, των πεπτιδίων, των νουκλεοσιδίων και των υδατοδιαλυτών βιταμινών.
Η αφαλάτωση είναι μία από τις τυπικές εφαρμογές των στηλών C18AQ στον καθαρισμό φλας για δείγματα, οι οποίες αφαιρεί τα συστατικά του αλατιού ή του ρυθμιστικού διαλύματος στον διαλύτη δείγματος για να διευκολυνθεί η εφαρμογή του δείγματος σε επόμενες μελέτες. Σε αυτή την ανάρτηση, το λαμπρό μπλε FCF με ισχυρή πολικότητα χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα και καθαρίστηκε στη στήλη C18AQ. Ο διαλύτης δείγματος αντικαταστάθηκε από οργανικό διαλύτη από ρυθμιστικό διάλυμα, διευκολύνοντας έτσι την ακόλουθη περιστροφική εξάτμιση, καθώς και την εξοικονόμηση διαλυτών και τον χρόνο λειτουργίας. Επιπλέον, η καθαρότητα του δείγματος βελτιώθηκε με την αφαίρεση ορισμένων ακαθαρσιών στο δείγμα.
Πειραματικό τμήμα
Εικόνα 2. Η χημική δομή του δείγματος.
Το λαμπρό μπλε FCF χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα σε αυτήν την ανάρτηση. Η καθαρότητα του ακατέργαστου δείγματος ήταν 86% και η χημική δομή του δείγματος παρουσιάστηκε στο σχήμα 2. Το διάλυμα του δείγματος στη συνέχεια εγχύθηκε στη στήλη Flash από έναν εγχυτήρα. Η πειραματική ρύθμιση του καθαρισμού φλας παρατίθεται στον Πίνακα 1.
| Οργανο | Μηχάνημα Sepabean ™2 | |||
| Κασέτες | 12 G SEPAFLASH C18 RP Flash Cartridge (σφαιρικό πυριτικό, 20-45 μm, 100 Α, Αριθμός παραγγελίας: SW-5222-012-SP) | 12 g sepaflash c18aq rp φλόγα flash (σφαιρικό σίλικα, 20-45 μm, 100 Α, αριθμός παραγγελίας: SW-5222-012-SP (aq)) | ||
| Μήκος κύματος | 254 nm | |||
| Κινητής φάσης | Διαλύτη A: νερό Διαλύτης Β: μεθανόλη | |||
| Ρυθμός ροής | 30 ml/λεπτό | |||
| Δειγμάτων φόρτωσης | 300 mg (λαμπρό μπλε FCF με καθαρότητα 86%) | |||
| Κλίση | Χρόνος (βιογραφικό) | Διαλύτης Β (%) | Χρόνος (βιογραφικό) | Διαλύτης Β (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Αποτελέσματα και συζήτηση
Χρησιμοποιήθηκε κασέτα flash SepaFlash C18AQ RP για δείγμα αφαλάτωσης και καθαρισμού. Χρησιμοποιήθηκε βαθμίδα βημάτων στην οποία χρησιμοποιήθηκε καθαρό νερό ως κινητής φάση στην αρχή της έκλουσης και τρέχει για 10 όγκους στήλης (CV). Όπως φαίνεται στο σχήμα 3, όταν χρησιμοποιείται το καθαρό νερό ως η κινητή φάση, το δείγμα διατηρήθηκε πλήρως στο φυσίγγιο flash. Στη συνέχεια, η μεθανόλη στην κινητή φάση αυξήθηκε άμεσα στο 100% και η κλίση διατηρήθηκε για 7,5 CV. Το δείγμα εκλούστηκε από 11,5 έως 13,5 cv. Στα συλλεγμένα κλάσματα, το διάλυμα δείγματος αντικαταστάθηκε από το ρυθμιστικό διάλυμα Nah2PO4 σε μεθανόλη. Συγκρίνοντας με εξαιρετικά υδατικό διάλυμα, η μεθανόλη ήταν πολύ πιο εύκολο να αφαιρεθεί με περιστροφική εξάτμιση στο επόμενο βήμα, γεγονός που διευκολύνει την ακόλουθη έρευνα.
Εικόνα 3. Το χρωματογράφημα φλας του δείγματος σε κασέτα C18AQ.
Για να συγκριθεί η συμπεριφορά συγκράτησης της κασέτας C18AQ και της κανονικής κασέτας C18 για δείγματα ισχυρής πολικότητας, πραγματοποιήθηκε παράλληλη δοκιμή σύγκρισης. Χρησιμοποιήθηκε μια κασέτα flash SepaFlash C18 RP και το χρωματογράφημα φλας για το δείγμα παρουσιάστηκε στο σχήμα 4. Για κανονικά κασέτες C18, η υψηλότερη αναλογία υδατικής φάσης είναι περίπου 90%. Επομένως, η κλίση εκκίνησης ρυθμίστηκε σε 10% μεθανόλη σε 90% νερό. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4, λόγω της κατάρρευσης της υδρόφοβης φάσης των αλυσίδων C18 που προκαλούνται από υψηλή υδατική αναλογία, το δείγμα διατηρήθηκε ελάχιστα στην κανονική κασέτα C18 και απευθείας εκλούστηκε από την κινητή φάση. Ως αποτέλεσμα, η λειτουργία του δείγματος αφαλάτωσης ή καθαρισμού δεν μπορεί να ολοκληρωθεί.
Εικόνα 4. Το χρωματογράφημα φλας του δείγματος σε κανονική κασέτα C18.
Σε σύγκριση με τη γραμμική κλίση, η χρήση της βαθμίδας βημάτων έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα:
1. Η χρήση του διαλύτη και ο χρόνος εκτέλεσης για τον καθαρισμό του δείγματος μειώνονται.
2. Το προϊόν -στόχος εξαλείφει σε μια απότομη κορυφή, η οποία μειώνει τον όγκο των συλλεγόμενων κλασμάτων και έτσι διευκολύνει την ακόλουθη περιστροφική εξάτμιση καθώς και την εξοικονόμηση χρόνου.
3. Το συλλεγόμενο προϊόν βρίσκεται σε μεθανόλη που είναι εύκολο να εξατμιστεί, μειώνοντας έτσι τον χρόνο ξήρανσης.
Συμπερασματικά, για τον καθαρισμό του δείγματος που είναι έντονα πολικό ή εξαιρετικά υδρόφιλο, sepaflash C18AQ RP φλας Flash που συνδυάζονται με το σύστημα παρασκευαστικής χρωματογραφίας Flash Sepabean ™ θα μπορούσε να προσφέρει μια γρήγορη και αποτελεσματική λύση.
Σχετικά με τα sepaflash δεσμευμένη σειρά C18 RP flash cartridges
Υπάρχει μια σειρά από τα φυσίγγια Flash SepaFlash C18AQ RP με διαφορετικές προδιαγραφές από την τεχνολογία Santai (όπως φαίνεται στον Πίνακα 2).
| Αριθμός αντικειμένου | Μέγεθος στήλης | Ρυθμός ροής (ml/min) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Πίνακας 2.
Υλικά συσκευασίας: σφαιρικό σίλικα C18 (AQ) υψηλής απόδοσης, 20-45 μm, 100 Α.
Logy (όπως φαίνεται στον Πίνακα 2).
Χρόνος δημοσίευσης: Αυγούστου-27-2018