Hongcheng Wang, Bo Xu
Κέντρο Ε&Α εφαρμογών
Εισαγωγή
Σύμφωνα με τις σχετικές πολικότητες της στατικής φάσης και της κινητής φάσης, η υγρή χρωματογραφία μπορεί να χωριστεί σε χρωματογραφία κανονικής φάσης (NPC) και χρωματογραφία ανάστροφης φάσης (RPC).Για το RPC, η πολικότητα της κινητής φάσης είναι ισχυρότερη από εκείνη της στατικής φάσης.Το RPC έχει γίνει το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο σε τρόπους διαχωρισμού υγρής χρωματογραφίας λόγω της υψηλής απόδοσης, της καλής ανάλυσης και του καθαρού μηχανισμού συγκράτησης.Επομένως, το RPC είναι κατάλληλο για τον διαχωρισμό και τον καθαρισμό διαφόρων πολικών ή μη πολικών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων αλκαλοειδών, υδατανθράκων, λιπαρών οξέων, στεροειδών, νουκλεϊκών οξέων, αμινοξέων, πεπτιδίων, πρωτεϊνών κ.λπ. Στο RPC, η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη στατική φάση είναι η μήτρα πυριτικής πηκτής η οποία συνδέεται με διάφορες λειτουργικές ομάδες, συμπεριλαμβανομένων των C18, C8, C4, φαινυλίου, κυανό, αμινοξέος, κ.λπ. Μεταξύ αυτών των συνδεδεμένων λειτουργικών ομάδων, η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη είναι η C18.Υπολογίζεται ότι περισσότερο από το 80% των RPC χρησιμοποιούν τώρα δεσμευμένη φάση C18.Επομένως, η στήλη χρωματογραφίας C18 έχει γίνει μια απαραίτητη καθολική στήλη για κάθε εργαστήριο.
Αν και η στήλη C18 μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ένα πολύ ευρύ φάσμα εφαρμογών, ωστόσο, για ορισμένα δείγματα που είναι πολύ πολικά ή πολύ υδρόφιλα, οι κανονικές στήλες C18 μπορεί να έχουν προβλήματα όταν χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό τέτοιων δειγμάτων.Στην RPC, οι κοινώς χρησιμοποιούμενοι διαλύτες έκλουσης μπορούν να ταξινομηθούν ανάλογα με την πολικότητα τους: νερό < μεθανόλη < ακετονιτρίλιο < αιθανόλη < τετραϋδροφουράνιο < ισοπροπανόλη.Για να εξασφαλιστεί καλή συγκράτηση στη στήλη για αυτά τα δείγματα (ισχυρά πολικά ή εξαιρετικά υδρόφιλα), είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθεί υψηλή αναλογία υδατικού συστήματος ως κινητή φάση.Ωστόσο, όταν χρησιμοποιείται σύστημα καθαρού νερού (συμπεριλαμβανομένου καθαρού νερού ή διαλύματος καθαρού αλατιού) ως κινητή φάση, η μακριά αλυσίδα άνθρακα στη στατική φάση της στήλης C18 τείνει να αποφεύγει το νερό και να αναμιγνύεται μεταξύ τους, με αποτέλεσμα τη στιγμιαία μείωση της ικανότητα συγκράτησης της στήλης ή ακόμα και καθόλου συγκράτηση.Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται «υδροφοβική κατάρρευση φάσης» (όπως φαίνεται στο αριστερό μέρος του Σχήματος 1).Αν και αυτή η κατάσταση είναι αναστρέψιμη όταν η στήλη πλένεται με οργανικούς διαλύτες όπως μεθανόλη ή ακετονιτρίλιο, μπορεί να προκαλέσει βλάβη στη στήλη.Επομένως, είναι απαραίτητο να αποτραπεί αυτή η κατάσταση.
Σχήμα 1. Το σχηματικό διάγραμμα των συνδεδεμένων φάσεων στην επιφάνεια του σιλικαζέλ σε κανονική στήλη C18 (αριστερά) και στήλη C18AQ (δεξιά).
Για την αντιμετώπιση των προαναφερθέντων προβλημάτων, οι κατασκευαστές χρωματογραφικών υλικών συσκευασίας έχουν κάνει τεχνικές βελτιώσεις.Μία από αυτές τις βελτιώσεις είναι η πραγματοποίηση ορισμένων τροποποιήσεων στην επιφάνεια της μήτρας του πυριτίου, όπως η εισαγωγή υδρόφιλων κυανομάδων (όπως φαίνεται στο δεξί μέρος του Σχήματος 1), για να γίνει η επιφάνεια του πήγματος πυριτίας πιο υδρόφιλη.Έτσι, οι αλυσίδες C18 στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου θα μπορούσαν να επεκταθούν πλήρως κάτω από υψηλά υδατικές συνθήκες και θα μπορούσε να αποφευχθεί η κατάρρευση της υδρόφοβης φάσης.Αυτές οι τροποποιημένες στήλες C18 ονομάζονται υδατικές στήλες C18, δηλαδή στήλες C18AQ, οι οποίες είναι σχεδιασμένες για συνθήκες υψηλής υδατικής έκλουσης και μπορούν να ανεχθούν 100% υδατικό σύστημα.Οι στήλες C18AQ έχουν εφαρμοστεί ευρέως στον διαχωρισμό και τον καθαρισμό ισχυρών πολικών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων οργανικών οξέων, πεπτιδίων, νουκλεοζιτών και υδατοδιαλυτών βιταμινών.
Η αφαλάτωση είναι μία από τις τυπικές εφαρμογές των στηλών C18AQ στον καθαρισμό φλας για δείγματα, ο οποίος αφαιρεί το αλάτι ή τα ρυθμιστικά συστατικά στο διαλύτη του δείγματος για να διευκολύνει την εφαρμογή του δείγματος σε επόμενες μελέτες.Σε αυτήν την ανάρτηση, το Brilliant Blue FCF με ισχυρή πολικότητα χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα και καθαρίστηκε στη στήλη C18AQ.Ο διαλύτης δείγματος αντικαταστάθηκε από οργανικό διαλύτη από ρυθμιστικό διάλυμα, διευκολύνοντας έτσι την ακόλουθη περιστροφική εξάτμιση καθώς και εξοικονόμηση διαλυτών και χρόνου λειτουργίας.Επιπλέον, η καθαρότητα του δείγματος βελτιώθηκε με την αφαίρεση ορισμένων ακαθαρσιών στο δείγμα.
Πειραματικό Τμήμα
Εικόνα 2. Η χημική δομή του δείγματος.
Το Brilliant Blue FCF χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα σε αυτήν την ανάρτηση.Η καθαρότητα του ακατέργαστου δείγματος ήταν 86% και η χημική δομή του δείγματος φαίνεται στο Σχήμα 2. Για την παρασκευή του διαλύματος δείγματος, 300 mg ακατέργαστου στερεού σε σκόνη Brilliant Blue FCF διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα NaH2PO4 1 M και ανακινήθηκαν καλά για να γίνουν ένα εντελώς διαυγές διάλυμα.Το διάλυμα του δείγματος στη συνέχεια εγχύθηκε στη στήλη flash με έναν εγχυτήρα.Η πειραματική ρύθμιση του καθαρισμού flash παρατίθεται στον Πίνακα 1.
| Οργανο | Μηχανή SepaBean™2 | |||
| Φυσίγγια | Κασέτα flash SepaFlash C18 RP 12 g (σφαιρικό πυρίτιο, 20 - 45 μm, 100 Å, Αριθμός παραγγελίας: SW-5222-012-SP) | Κασέτα φλας 12 g SepaFlash C18AQ RP (σφαιρικό πυρίτιο, 20 - 45 μm, 100 Å, αριθμός παραγγελίας：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Μήκος κύματος | 254 nm | |||
| Κινητή φάση | Διαλύτης Α: Νερό Διαλύτης Β: Μεθανόλη | |||
| Ρυθμός ροής | 30 mL/min | |||
| Φόρτωση δείγματος | 300 mg (Brilliant Blue FCF με καθαρότητα 86%) | |||
| Βαθμίδα | Χρόνος (Βιογραφικό) | Διαλύτης Β (%) | Χρόνος (Βιογραφικό) | Διαλύτης Β (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Αποτελέσματα και συζήτηση
Ένα φυσίγγιο φλας SepaFlash C18AQ RP χρησιμοποιήθηκε για την αφαλάτωση και τον καθαρισμό του δείγματος.Χρησιμοποιήθηκε βαθμίδα σταδίου στην οποία χρησιμοποιήθηκε καθαρό νερό ως κινητή φάση στην αρχή της έκλουσης και έτρεξε για 10 όγκους στήλης (CV).Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, όταν χρησιμοποιείται καθαρό νερό ως κινητή φάση, το δείγμα διατηρήθηκε πλήρως στο φυσίγγιο φλας.Στη συνέχεια, η μεθανόλη στην κινητή φάση αυξήθηκε άμεσα στο 100% και η κλίση διατηρήθηκε για 7,5 CV.Το δείγμα εκλούστηκε από 11,5 έως 13,5 CV.Στα συλλεχθέντα κλάσματα, το διάλυμα του δείγματος αντικαταστάθηκε από ρυθμιστικό διάλυμα NaH2PO4 σε μεθανόλη.Σε σύγκριση με το εξαιρετικά υδατικό διάλυμα, η μεθανόλη ήταν πολύ πιο εύκολο να αφαιρεθεί με περιστροφική εξάτμιση στο επόμενο στάδιο, γεγονός που διευκολύνει την ακόλουθη έρευνα.
Εικόνα 3. Το χρωματογράφημα flash του δείγματος σε φυσίγγιο C18AQ.
Για να συγκριθεί η συμπεριφορά συγκράτησης του φυσιγγίου C18AQ και του κανονικού φυσιγγίου C18 για δείγματα ισχυρής πολικότητας, πραγματοποιήθηκε παράλληλη συγκριτική δοκιμή.Χρησιμοποιήθηκε ένα φυσίγγιο φλας SepaFlash C18 RP και το χρωματογράφημα flash για το δείγμα φαίνεται στο Σχήμα 4. Για κανονικά φυσίγγια C18, η υψηλότερη ανεκτή αναλογία υδατικής φάσης είναι περίπου 90%.Επομένως η κλίση έναρξης ρυθμίστηκε σε 10% μεθανόλη σε 90% νερό.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, λόγω της κατάρρευσης της υδρόφοβης φάσης των αλυσίδων C18 που προκαλείται από την υψηλή υδατική αναλογία, το δείγμα μόλις συγκρατήθηκε στο κανονικό φυσίγγιο C18 και εκλούστηκε απευθείας από την κινητή φάση.Ως αποτέλεσμα, η λειτουργία αφαλάτωσης ή καθαρισμού δείγματος δεν μπορεί να ολοκληρωθεί.
Εικόνα 4. Το χρωματογράφημα flash του δείγματος σε κανονικό φυσίγγιο C18.
Σε σύγκριση με τη γραμμική κλίση, η χρήση της κλίσης βήματος έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα:
1. Η χρήση διαλύτη και ο χρόνος λειτουργίας για τον καθαρισμό του δείγματος μειώνονται.
2. Το προϊόν-στόχος εκλούεται σε μια απότομη κορυφή, η οποία μειώνει τον όγκο των συλλεγόμενων κλασμάτων και έτσι διευκολύνει την ακόλουθη περιστροφική εξάτμιση καθώς και εξοικονόμηση χρόνου.
3. Το προϊόν που συλλέγεται είναι σε μεθανόλη η οποία είναι εύκολο να εξατμιστεί, με αποτέλεσμα να μειώνεται ο χρόνος στεγνώματος.
Συμπερασματικά, για τον καθαρισμό του δείγματος που είναι έντονα πολικό ή εξαιρετικά υδρόφιλο, τα φυσίγγια φλας SepaFlash C18AQ RP σε συνδυασμό με το προπαρασκευαστικό σύστημα χρωματογραφίας flash SepaBean™ Machine θα μπορούσαν να προσφέρουν μια γρήγορη και αποτελεσματική λύση.
Σχετικά με τα δοχεία φλας SepaFlash Bonded Series C18 RP
Υπάρχει μια σειρά από δοχεία φλας SepaFlash C18AQ RP με διαφορετικές προδιαγραφές από την τεχνολογία Santai (όπως φαίνεται στον Πίνακα 2).
| Αριθμός αντικειμένου | Μέγεθος στήλης | Ρυθμός ροής (mL/min) | Μέγιστη πίεση (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 γρ | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 γρ | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 γρ | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 γρ | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 γρ | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 γρ | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 γρ | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 γρ | 40-80 | 250/17.2 |
Πίνακας 2. Κασέτες φλας SepaFlash C18AQ RP.
Υλικά συσκευασίας: Σφαιρικό πυρίτιο υψηλής απόδοσης C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
λογικό (όπως φαίνεται στον Πίνακα 2).
Ώρα δημοσίευσης: Αυγ-27-2018