Rui Huang, Bo xu
F & E -Zentrum für Anwendungen
Einführung
Ein Peptid ist eine Verbindung, die aus Aminosäuren besteht, von denen jede aufgrund der verschiedenen Arten und Reihenfolge von Aminosäureresten einzigartige physikalische und chemische Eigenschaften aufweist, die seine Sequenz bilden. Mit der Entwicklung der chemischen Synthese der festen Phasen hat die chemische Synthese verschiedener aktiver Peptide große Fortschritte erzielt. Aufgrund der komplizierten Zusammensetzung des durch festen Phasensynthese erhaltenen Peptids sollte das Endprodukt jedoch durch zuverlässige Trennungsmethoden gereinigt werden. Zu den häufig verwendeten Reinigungsmethoden für Peptide gehören die Ionenaustauschchromatographie (IEC) und die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC), die die Nachteile von niedriger Probenbeladungskapazität, hohe Kosten für Trennungsmedien, komplizierte und kostspielige Trennungsausrüstung usw. aufweisen, für die schnelle Reinigung von Kleinmolekülen-Peilen (MW <1 KDA). Für die schnelle Reinigung von Thymopentin (TP-5) wurde eine Sepaflash-RP C18-Kartusche verwendet, und das Zielprodukt, das die Anforderungen erfüllt, wurde erhoben.
Abbildung 1. 20 gewöhnliche Aminosäuren (reproduziert von www.bachem.com).
Es gibt 20 Arten von Aminosäuren, die in der Zusammensetzung von Peptiden häufig sind. Diese Aminosäuren können gemäß ihrer Polarität und Säure-Basis-Eigenschaft in die folgenden Gruppen unterteilt werden: unpolar (hydrophobe), polar (ungeladen), sauer oder basisch (wie in Abbildung 1 gezeigt). In einer Peptidsequenz, wenn die Aminosäuren, die die Sequenz bilden, größtenteils polare sind (wie in rosa Farbe in Abbildung 1 markiert) wie Cystein, Glutamin, Sparagin, Serin, Threonin, Tyrosin usw., könnte dieses Peptid eine starke Polarität haben und in Wasser stark löslich sein. Während des Reinigungsverfahrens für diese starken polaren Peptidproben durch umgekehrte Phasenchromatographie tritt ein Phänomen namens hydrophobe Phasenkollaps auf (siehe zuvor veröffentlichte Anwendungsnote von Santai-Technologien: kollabarer Phasenkollaps, AQ-Umkehrphasenchromatographie-Spalten und ihre Anwendungen). Im Vergleich zu den regulären C18 -Säulen eignen sich die verbesserten C18AQ -Säulen am besten für die Reinigung starker polarer oder hydrophiler Proben. In diesem Beitrag wurde ein starkes polares Peptid als Probe verwendet und durch eine C18AQ -Säule gereinigt. Infolgedessen wurde das Zielprodukt erfüllt, das die Anforderungen erfüllt, und konnte in den folgenden Forschungen und Entwicklung verwendet werden.
| Instrument | Sepabean™Maschine 2 | |||
| Patronen | 12 g Sepaflash C18 RP Flash-Patrone (sphärische Kieselsäure, 20-45 μm, 100 Å, Order Nunber: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP Flash-Patrone (sphärische Siliciumdioxid, 20-45 μm, 100 Å, Bestellnummer: SW-5222-012-SP (aq))) | ||
| Wellenlänge | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobile Phase | Lösungsmittel A: Wasser Lösungsmittel B: Acetonitril | |||
| Durchflussrate | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Probenbelastung | 30 mg | |||
| Gradient | Zeit (Lebenslauf) | Lösungsmittel B (%) | Zeit (min) | Lösungsmittel B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Ergebnisse und Diskussion
Um die Reinigungsleistung für die polare Peptidprobe zwischen der regulären C18 -Säule und der C18AQ -Säule zu vergleichen, verwendeten wir eine reguläre C18 -Spalte für die Flash -Reinigung der Probe als Start. Wie in 2 gezeigt, wurde die Probe aufgrund des kürzlich durch hohen wässrigen Verhältnisses verursachten C18 -Ketten durch den hydrophoben Phasenkollaps der C18 -Kartusche kaum aufbewahrt und von der mobilen Phase direkt ausgelöst. Infolgedessen wurde die Probe nicht effektiv getrennt und gereinigt.
Abbildung 2. Das Flash -Chromatogramm der Probe auf einer regulären C18 -Patrone.
Als nächstes verwendeten wir eine C18AQ -Spalte für die Flash -Reinigung der Probe. Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurde das Peptid effektiv auf der Säule aufbewahrt und dann herausgegeben. Das Zielprodukt wurde von den Verunreinigungen in der Rohprobe getrennt und gesammelt. Nach der Lyophilisierung und dann von HPLC analysiert, hat das gereinigte Produkt eine Reinheit von 98,2% und könnte für die nächste Stufe Forschung und Entwicklung weiter genutzt werden.
Abbildung 3. Das Flash -Chromatogramm der Probe auf einer C18AQ -Patrone.
Zusammenfassend lässt sich sagen™Die Maschine kann eine schnelle und effektive Lösung für die Reinigung starker polarer oder hydrophiler Proben bieten.
Es gibt eine Reihe der Sepaflash -C18AQ -RP -Flash -Patronen mit unterschiedlichen Spezifikationen aus der Santai -Technologie (wie in Tabelle 2 gezeigt).
| Artikelnummer | Säulengröße | Durchflussrate (ml/min) | Max.pressur (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabelle 2. Sepaflash C18AQ RP Flash -Patronen. Verpackungsmaterialien: Hocheffizienz kugelförmiger C18 (aq) -bonded Silica, 20-45 μm, 100 Å.
Weitere Informationen zu detaillierten Spezifikationen des Sepabean ™ -Machags oder zu den Bestellinformationen zu den Flash -Patronen der Sepaflash -Serie finden Sie auf unserer Website.
Postzeit: Okt 12-2018