Hongcheng Wang, Bo Xu
Forschungs- und Entwicklungszentrum für Anwendungen
Einführung
Entsprechend den relativen Polaritäten der stationären Phase und der mobilen Phase kann die Flüssigkeitschromatographie in Normalphasenchromatographie (NPC) und Umkehrphasenchromatographie (RPC) unterteilt werden.Bei RPC ist die Polarität der mobilen Phase stärker als die der stationären Phase.RPC hat sich aufgrund seiner hohen Effizienz, guten Auflösung und seines klaren Retentionsmechanismus zum am häufigsten verwendeten Trennverfahren in der Flüssigkeitschromatographie entwickelt.Daher eignet sich RPC für die Trennung und Reinigung verschiedener polarer oder unpolarer Verbindungen, einschließlich Alkaloiden, Kohlenhydraten, Fettsäuren, Steroiden, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Peptiden, Proteinen usw. In RPC ist die am häufigsten verwendete stationäre Phase die Kieselgelmatrix, die mit verschiedenen funktionellen Gruppen verbunden ist, darunter C18, C8, C4, Phenyl, Cyano, Amino usw. Unter diesen gebundenen funktionellen Gruppen ist C18 die am häufigsten verwendete.Es wird geschätzt, dass mittlerweile mehr als 80 % der RPC die gebundene C18-Phase verwenden.Daher ist die C18-Chromatographiesäule zu einer unverzichtbaren Universalsäule für jedes Labor geworden.
Obwohl C18-Säulen in einem sehr breiten Anwendungsspektrum eingesetzt werden können, kann es bei einigen Proben, die sehr polar oder stark hydrophil sind, zu Problemen bei der Reinigung solcher Proben kommen.In RPC können die üblicherweise verwendeten Elutionslösungsmittel nach ihrer Polarität geordnet werden: Wasser < Methanol < Acetonitril < Ethanol < Tetrahydrofuran < Isopropanol.Um eine gute Retention dieser Proben (stark polar oder stark hydrophil) auf der Säule zu gewährleisten, muss ein hoher Anteil an wässrigem System als mobile Phase verwendet werden.Wenn jedoch ein reines Wassersystem (einschließlich reinem Wasser oder reiner Salzlösung) als mobile Phase verwendet wird, neigt die lange Kohlenstoffkette in der stationären Phase der C18-Säule dazu, das Wasser zu meiden und sich miteinander zu vermischen, was zu einer sofortigen Abnahme der führt Retentionskapazität der Säule oder gar keine Retention.Dieses Phänomen wird als „Kollaps der hydrophoben Phase“ bezeichnet (wie im linken Teil von Abbildung 1 dargestellt).Obwohl diese Situation reversibel ist, wenn die Säule mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol oder Acetonitril gewaschen wird, kann sie dennoch zu Schäden an der Säule führen.Daher ist es notwendig, das Eintreten dieser Situation zu verhindern.
Abbildung 1. Das schematische Diagramm der gebundenen Phasen auf der Oberfläche von Kieselgel in einer regulären C18-Säule (links) und einer C18AQ-Säule (rechts).
Um die oben genannten Probleme anzugehen, haben die Hersteller von chromatographischen Verpackungsmaterialien technische Verbesserungen vorgenommen.Eine dieser Verbesserungen besteht darin, einige Modifikationen an der Oberfläche der Silica-Matrix vorzunehmen, beispielsweise die Einführung hydrophiler Cyanogruppen (wie im rechten Teil von Abbildung 1 dargestellt), um die Oberfläche des Silicagels hydrophiler zu machen.Dadurch konnten die C18-Ketten auf der Silica-Oberfläche unter stark wässrigen Bedingungen vollständig verlängert und der Kollaps der hydrophoben Phase vermieden werden.Diese modifizierten C18-Säulen werden als wässrige C18-Säulen bezeichnet, nämlich C18AQ-Säulen, die für stark wässrige Elutionsbedingungen ausgelegt sind und ein 100 % wässriges System tolerieren können.C18AQ-Säulen werden häufig zur Trennung und Reinigung stark polarer Verbindungen eingesetzt, darunter organische Säuren, Peptide, Nukleoside und wasserlösliche Vitamine.
Die Entsalzung ist eine der typischen Anwendungen von C18AQ-Säulen bei der Flash-Reinigung von Proben, bei der die Salz- oder Pufferkomponenten im Probenlösungsmittel entfernt werden, um die Verwendung der Probe in nachfolgenden Studien zu erleichtern.In diesem Beitrag wurde der Brilliant Blue FCF mit starker Polarität als Probe verwendet und auf der C18AQ-Säule gereinigt.Das Probenlösungsmittel wurde durch organisches Lösungsmittel aus der Pufferlösung ersetzt, wodurch die anschließende Rotationsverdampfung erleichtert und Lösungsmittel und Betriebszeit eingespart wurden.Darüber hinaus wurde die Reinheit der Probe durch die Entfernung einiger Verunreinigungen in der Probe verbessert.
experimenteller Abschnitt
Abbildung 2. Die chemische Struktur der Probe.
Als Probe wurde in diesem Beitrag der Brilliant Blue FCF verwendet.Die Reinheit der Rohprobe betrug 86 % und die chemische Struktur der Probe ist in Abbildung 2 dargestellt. Zur Herstellung der Probenlösung wurden 300 mg pulverförmiger Rohfeststoff von Brilliant Blue FCF in 1 M NaH2PO4-Pufferlösung gelöst und gut geschüttelt eine völlig klare Lösung.Die Probenlösung wurde dann mit einem Injektor in die Flash-Säule injiziert.Der Versuchsaufbau der Flash-Reinigung ist in Tabelle 1 aufgeführt.
| Instrument | SepaBean™-Maschine2 | |||
| Patronen | 12 g SepaFlash C18 RP Blitzkartusche (sphärisches Silikat, 20 - 45 μm, 100 Å, Bestellnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP Blitzkartusche (sphärisches Silikat, 20 - 45 μm, 100 Å, Bestellnummer: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Wellenlänge | 254 nm | |||
| Mobile Phase | Lösungsmittel A: Wasser Lösungsmittel B: Methanol | |||
| Fließrate | 30 ml/min | |||
| Laden der Probe | 300 mg (Brilliant Blue FCF mit einer Reinheit von 86 %) | |||
| Gradient | Zeit (Lebenslauf) | Lösungsmittel B (%) | Zeit (Lebenslauf) | Lösungsmittel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultate und Diskussion
Zur Probenentsalzung und -reinigung wurde eine SepaFlash C18AQ RP-Blitzkartusche verwendet.Es wurde ein Stufengradient verwendet, bei dem zu Beginn der Elution reines Wasser als mobile Phase verwendet und über 10 Säulenvolumina (CV) laufen gelassen wurde.Wie in Abbildung 3 dargestellt, wurde die Probe bei Verwendung von reinem Wasser als mobile Phase vollständig auf der Flash-Kartusche zurückgehalten.Als nächstes wurde der Methanolgehalt in der mobilen Phase direkt auf 100 % erhöht und der Gradient bei 7,5 CV aufrechterhalten.Die Probe wurde bei 11,5 bis 13,5 CV eluiert.In den gesammelten Fraktionen wurde die Probenlösung von NaH2PO4-Pufferlösung durch Methanol ersetzt.Im Vergleich zu stark wässrigen Lösungen ließ sich Methanol im nachfolgenden Schritt viel einfacher durch Rotationsverdampfung entfernen, was die folgende Untersuchung erleichtert.
Abbildung 3. Das Flash-Chromatogramm der Probe auf einer C18AQ-Kartusche.
Um das Retentionsverhalten der C18AQ-Kartusche und der regulären C18-Kartusche für Proben mit starker Polarität zu vergleichen, wurde ein paralleler Vergleichstest durchgeführt.Es wurde eine SepaFlash C18 RP Flash-Kartusche verwendet und das Flash-Chromatogramm für die Probe ist in Abbildung 4 dargestellt. Für normale C18-Kartuschen beträgt das höchste tolerierte wässrige Phasenverhältnis etwa 90 %.Daher wurde der Startgradient auf 10 % Methanol in 90 % Wasser eingestellt.Wie in Abbildung 4 dargestellt, wurde die Probe aufgrund des durch den hohen Wasseranteil verursachten hydrophoben Phasenkollapses der C18-Ketten kaum auf der regulären C18-Kartusche zurückgehalten und direkt von der mobilen Phase eluiert.Infolgedessen kann der Vorgang der Probenentsalzung oder -reinigung nicht abgeschlossen werden.
Abbildung 4. Das Flash-Chromatogramm der Probe auf einer normalen C18-Kartusche.
Im Vergleich zum linearen Gradienten bietet die Verwendung des Stufengradienten die folgenden Vorteile:
1. Der Lösungsmittelverbrauch und die Laufzeit für die Probenreinigung werden reduziert.
2. Das Zielprodukt eluiert in einem scharfen Peak, was das Volumen der gesammelten Fraktionen verringert und so die anschließende Rotationsverdampfung erleichtert und Zeit spart.
3. Das gesammelte Produkt befindet sich in Methanol, das leicht verdampft werden kann, wodurch die Trocknungszeit verkürzt wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass für die Reinigung stark polarer oder stark hydrophiler Proben die SepaFlash C18AQ RP Flash-Kartuschen in Kombination mit dem präparativen Flash-Chromatographiesystem SepaBean™ Machine eine schnelle und effiziente Lösung bieten könnten.
Über die Blitzmodule der SepaFlash Bonded Serie C18 RP
Es gibt eine Reihe der SepaFlash C18AQ RP-Blitzmodule mit unterschiedlichen Spezifikationen von Santai Technology (siehe Tabelle 2).
| Artikelnummer | Spaltengröße | Fließrate (ml/min) | Maximaler Druck (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabelle 2. SepaFlash C18AQ RP-Blitzkassetten.
Packungsmaterialien: Hocheffizientes sphärisches C18(AQ)-gebundenes Siliziumdioxid, 20–45 μm, 100 Å.
logie (wie in Tabelle 2 gezeigt).
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 27. August 2018