Hongcheng Wang, Bo xu
F & E -Zentrum für Anwendungen
Einführung
Gemäß den relativen Polaritäten der stationären Phase und der mobilen Phase kann die Flüssigchromatographie in normale Phasenchromatographie (NPC) und umgekehrte Phasenchromatographie (RPC) unterteilt werden. Für RPC ist die Polarität der mobilen Phase stärker als die der stationären Phase. RPC ist aufgrund seiner hohen Effizienz, einer guten Auflösung und des klaren Retentionsmechanismus der am häufigsten verwendete in Flüssigchromatographie -Trennmodi geworden. Daher eignet sich RPC für die Trennung und Reinigung verschiedener polarer oder nicht polarer Verbindungen, einschließlich Alkaloiden, Kohlenhydrate, Fettsäuren, Steroiden, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Peptiden, Proteinen usw. In RPC. Amino usw. Unter diesen gebundenen funktionellen Gruppen ist die am häufigsten verwendete C18. Es wird geschätzt, dass mehr als 80% der RPC jetzt die C18 -gebundene Phase verwenden. Daher ist die C18-Chromatographie-Säule für jedes Labor zu einer Must-Have-Universalsäule geworden.
Obwohl die C18 -Säule in einem sehr breiten Bereich von Anwendungen verwendet werden kann, können regelmäßige C18 -Säulen für einige Proben, die sehr polar oder hochhydrophil sind, Probleme haben, wenn sie zur Reinigung solcher Proben verwendet werden. In RPC können die häufig verwendeten Elutionslösungsmittel nach ihrer Polarität geordnet werden: Wasser <Methanol <Acetonitril <Ethanol <Tetrahydrofuran <Isopropanol. Um eine gute Retention an der Säule für diese Proben (starke polare oder hochhydrophile) zu gewährleisten, ist ein hoher Anteil des wässrigen Systems erforderlich, um als mobile Phase verwendet zu werden. Bei der Verwendung von reinem Wassersystem (einschließlich reiner Wasser- oder reiner Salzlösung) als mobile Phase neigt die lange Kohlenstoffkette in der stationären Phase der C18 -Säule dazu, das Wasser zu vermeiden und sich miteinander zu mischen, was zu einer momentanen Abnahme der Retentionskapazität der Säule oder sogar ohne Retention führt. Dieses Phänomen wird als „hydrophober Phasenkollaps“ bezeichnet (wie im linken Teil von Abbildung 1 gezeigt). Obwohl diese Situation reversibel ist, wenn die Säule mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol oder Acetonitril gewaschen wird, kann sie dennoch Schäden an der Säule verursachen. Daher ist es notwendig, diese Situation zu verhindern.
Abbildung 1. Das schematische Diagramm der gebundenen Phasen auf der Oberfläche des Kieselgels in der regulären C18 -Säule (links) und der C18AQ -Säule (rechts).
Um die oben genannten Probleme anzugehen, haben die Hersteller von chromatographischen Verpackungsmaterialien technische Verbesserungen vorgenommen. Eine dieser Verbesserungen besteht darin, einige Modifikationen auf der Oberfläche der Siliciumdioxidmatrix vorzunehmen, z. Somit konnten die C18 -Ketten auf der Siliciumdioxidoberfläche unter stark wässrigen Bedingungen vollständig verlängert werden und der Zusammenbruch der hydrophoben Phasen könnte vermieden werden. Diese modifizierten C18 -Säulen werden als wässrige C18 -Säulen bezeichnet, nämlich C18AQ -Säulen, die für hoch wässrige Elutionsbedingungen ausgelegt sind und 100% wässriges System tolerieren können. C18AQ-Säulen wurden bei der Trennung und Reinigung starker polaren Verbindungen, einschließlich organischer Säuren, Peptiden, Nucleoside und wasserlöslichen Vitaminen, weit verbreitet.
Die Entsalzierung ist eine der typischen Anwendungen von C18AQ -Säulen in der Flash -Reinigung für Proben, wodurch die Salz- oder Pufferkomponenten im Probenlösungsmittel entfernt werden, um die Anwendung der Probe in nachfolgenden Studien zu erleichtern. In diesem Beitrag wurde der brillante blaue FCF mit starker Polarität als Probe verwendet und auf der C18AQ -Säule gereinigt. Das Probenlösungsmittel wurde durch organisches Lösungsmittel aus der Pufferlösung ersetzt, wodurch die folgende Rotationsverdampfung sowie die Sparen von Lösungsmitteln und die Betriebszeit erleichtert wurden. Darüber hinaus wurde die Reinheit der Probe verbessert, indem einige Verunreinigungen in der Probe entfernt wurden.
Versuchsabschnitt
Abbildung 2. Die chemische Struktur der Probe.
Der brillante blaue FCF wurde als Beispiel in diesem Beitrag verwendet. Die Reinheit der Rohprobe betrug 86% und die chemische Struktur der Probe wurde in Abbildung 2 dargestellt. Um die Probenlösung herzustellen, wurde 300 mg pulverförmiger Rohstoff -Feststoff aus brillantem blauem FCF in 1 m NAH2PO4 -Pufferlösung gelöst und schüttelte gut, um eine vollständig klare Lösung zu werden. Die Probenlösung wurde dann durch einen Injektor in die Flash -Spalte injiziert. Die experimentelle Einrichtung der Flash -Reinigung ist in Tabelle 1 aufgeführt.
| Instrument | Sepabean ™ Maschine2 | |||
| Patronen | 12 g Sepaflash C18 RP Flash-Patrone (sphärische Kieselsäure, 20-45 μm, 100 Å, Bestellzahl: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash-Patrone (kugelförmige Silica, 20-45 μm, 100 Å, Bestellzahl: SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Wellenlänge | 254 nm | |||
| Mobile Phase | Lösungsmittel a: Wasser Lösungsmittel B: Methanol | |||
| Durchflussrate | 30 ml/min | |||
| Probenbelastung | 300 mg (Brilliant Blue FCF mit der Reinheit von 86%) | |||
| Gradient | Zeit (Lebenslauf) | Lösungsmittel B (%) | Zeit (Lebenslauf) | Lösungsmittel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Ergebnisse und Diskussion
Eine Sepaflash C18AQ RP -Flash -Patrone wurde zur Entsalzierung und Reinigung von Proben verwendet. Der Stiefgradient wurde verwendet, bei dem reines Wasser zu Beginn der Elution als mobile Phase verwendet wurde und für 10 Säulenvolumina (CV) ausgeführt wurde. Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurde die Probe bei der Verwendung von reinem Wasser als mobile Phase vollständig auf der Flash -Patrone zurückgehalten. Als nächstes wurde das Methanol in der mobilen Phase direkt auf 100% erhöht und der Gradient für 7,5 CV gehalten. Die Probe wurde von 11,5 bis 13,5 cv ausgelöst. In den gesammelten Fraktionen wurde die Probenlösung durch die NAH2PO4 -Pufferlösung durch Methanol ersetzt. Im Vergleich zur hoch wässrigen Lösung war Methanol im nachfolgenden Schritt viel einfacher zu entfernen, was die folgenden Untersuchungen erleichtert.
Abbildung 3. Das Flash -Chromatogramm der Probe auf einer C18AQ -Patrone.
Um das Retentionsverhalten der C18AQ -Kartusche und der regulären C18 -Patrone für Proben der starken Polarität zu vergleichen, wurde paralleler Vergleichstest durchgeführt. Eine Sepaflash -C18 -RP -Flash -Patrone wurde verwendet und das Flash -Chromatogramm für die Probe wurde in Abbildung 4 dargestellt. Für reguläre C18 -Patronen beträgt das höchste tolerierte wässrige Phasenverhältnis etwa 90%. Daher wurde der Startverlauf auf 10% Methanol in 90% Wasser eingestellt. Wie in Abbildung 4 gezeigt, wurde die Probe aufgrund des kürzlich durch hohen wässrigen Verhältnisses verursachten Kollaps der C18 -Ketten auf der regulären C18 -Kartusche kaum aufbewahrt und von der mobilen Phase direkt ausgelöst. Infolgedessen kann der Betrieb von Probenentaus oder Reinigung nicht abgeschlossen werden.
Abbildung 4. Das Flash -Chromatogramm der Probe auf einer regulären C18 -Patrone.
Im Vergleich zum linearen Gradienten hat die Verwendung des Schrittgradienten die folgenden Vorteile:
1. Lösungsmittelverbrauch und Laufzeit für die Probenreinigung werden reduziert.
2. Das Zielprodukt ist in einem scharfen Peak, wodurch das Volumen der gesammelten Fraktionen reduziert und so die folgende Rotationsverdampfung sowie die Sparzeit erleichtert.
3. Das gesammelte Produkt befindet sich in Methanol, das leicht verdunstet zu werden, wodurch die Trocknungszeit verkürzt wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass für die Reinigung der Stichprobe, die stark polar oder stark hydrophil ist, sepaflash C18AQ RP -Blitzpatronen, die mit der Sepababean ™ -Maschine vorbereitete Flash -Chromatographie -Systeme kombiniert werden, eine schnelle und effiziente Lösung bieten können.
Über die Sepaflash Bonded Series C18 RP Flash -Patronen
Es gibt eine Reihe der Sepaflash -C18AQ -RP -Flash -Patronen mit unterschiedlichen Spezifikationen aus der Santai -Technologie (wie in Tabelle 2 gezeigt).
| Artikelnummer | Säulengröße | Durchflussrate (ml/min) | Max.pressur (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabelle 2. Sepaflash C18AQ RP Flash -Patronen.
Verpackungsmaterialien: Hocheffizienz kugelförmiger C18 (aq) -bonded Silica, 20-45 μm, 100 Å.
Logy (wie in Tabelle 2 gezeigt).
Postzeit: Aug-27-2018