Rui Huang, Bo XU
Application R&D Center
Indledning
Et peptid er en forbindelse sammensat af aminosyrer, som hver har unikke fysiske og kemiske egenskaber på grund af de forskellige typer og rækkefølge af aminosyrerester, der udgør sin sekvens. Med udviklingen af kemisk syntese af fast fase har den kemiske syntese af forskellige aktive peptider gjort store fremskridt. På grund af den komplicerede sammensætning af peptidet opnået ved fast fasesyntese, skal det endelige produkt imidlertid renses ved pålidelige separationsmetoder. De almindeligt anvendte oprensningsmetoder til peptider inkluderer ionudvekslingskromatografi (IEC) og omvendt fase høj ydeevne væskekromatografi (RP-HPLC), som har ulemperne ved lav prøvebelastningskapacitet, høje omkostninger ved separationsmedier, kompliceret og kostbar separationsudstyr, osv. Til hurtig oprensning af små molekule peptider (MW <1 KDA), en vellykket separationsudstyr, osv. For hurtig oprensning af små molekule peptid Teknologier, hvor en Sepaflash RP C18-patron blev anvendt til hurtig oprensning af thymopentin (TP-5) og målproduktmødet, blev kravene opnået.
Figur 1. 20 almindelige aminosyrer (gengivet fra www.bachem.com).
Der er 20 slags aminosyrer, der er almindelige i sammensætningen af peptider. Disse aminosyrer kan opdeles i følgende grupper i henhold til deres polaritet og syre-baseegenskab: ikke-polar (hydrofob), polær (uladet), sur eller basisk (som vist i figur 1). I en peptidsekvens, hvis aminosyrerne, der udgør sekvensen, for det meste er polære (som markeret i lyserød farve i figur 1), såsom cystein, glutamin, asparagin, serin, threonin, tyrosin osv. Så kan dette peptid have en stærk polaritet og være højt opløselig i vand. Under oprensningsproceduren for disse stærke polære peptidprøver ved omvendt fase-kromatografi vil et fænomen kaldet hydrofob fase-sammenbrud forekomme (se en tidligere offentliggjort applikationsnotat af Santai Technologies: Hydrofob fase-kollaps, AQ omvendt fasekromatografikolonner og deres anvendelser). Sammenlignet med de almindelige C18 -søjler er de forbedrede C18AQ -søjler bedst egnet til oprensning af stærke polære eller hydrofile prøver. I dette indlæg blev et stærkt polært peptid anvendt som prøven og oprenset med en C18AQ -søjle. Som et resultat blev målproduktmødet kravene opnået og kunne bruges i følgende forskning og udvikling.
| Instrument | Sepabean™maskine 2 | |||
| Patroner | 12 G Sepaflash C18 RP Flash Cartridge (sfærisk silica, 20-45 μm, 100 Å, bestil nunber ： SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridge (sfærisk silica, 20-45 μm, 100 Å, ordrenummer ： SW-5222-012-SP (aq)) | ||
| Bølgelængde | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobil fase | Opløsningsmiddel A: Vand Opløsningsmiddel B: Acetonitril | |||
| Strømningshastighed | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Prøveindlæsning | 30 mg | |||
| Gradient | Tid (CV) | Opløsningsmiddel B (%) | Tid (min) | Opløsningsmiddel B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Resultater og diskussion
For at sammenligne oprensningsydelsen for den polære peptidprøve mellem almindelig C18 -søjle og C18AQ -kolonne anvendte vi en almindelig C18 -søjle til flashoprensning af prøven som en start. Som vist i figur 2 på grund af den hydrofobe fase sammenbrud af C18 -kæderne forårsaget af et højt vandigt forhold blev prøven næppe bevaret på den almindelige C18 -patron og blev direkte elueret ud af den mobile fase. Som et resultat blev prøven ikke effektivt adskilt og oprenset.
Figur 2. Flashchromatogrammet af prøven på en almindelig C18 -patron.
Dernæst brugte vi en C18AQ -søjle til flashoprensning af prøven. Som vist i figur 3 blev peptidet effektivt tilbageholdt på søjlen og derefter elueret ud. Målproduktet blev adskilt fra urenhederne i den rå prøve og opsamlet. Efter lyofilisering og derefter analyseret ved HPLC har det oprensede produkt en renhed på 98,2% og kunne bruges yderligere til næste trin forskning og udvikling.
Figur 3. Flash -kromatogrammet af prøven på en C18AQ -patron.
Afslutningsvis, Sepaflash C18AQ RP Flash -patron kombineret med flashchromatografisystemet Sepabean™Maskinen kunne tilbyde en hurtig og effektiv løsning til oprensning af stærke polære eller hydrofile prøver.
Der er en serie af Sepaflash C18AQ RP -flashpatronerne med forskellige specifikationer fra Santai -teknologien (som vist i tabel 2).
| Varenummer | Kolonstørrelse | Strømningshastighed (ml/min) | Max.pressure (Psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabel 2. Sepaflash C18AQ RP Flash -patroner. Pakningsmaterialer: Højeffektiv sfærisk C18 (aq) -bundet silica, 20-45 μm, 100 Å.
For yderligere information om detaljerede specifikationer for Sepabean ™ -maskinen eller bestillingsoplysningerne om Sepaflash -serien Flash -patroner, kan du besøge vores websted.
Posttid: oktober-12-2018