Rui Huang, Bo Xu
Application R&D Center
Introduktion
Et peptid er en forbindelse sammensat af aminosyrer, som hver især har unikke fysiske og kemiske egenskaber på grund af de forskellige typer og rækkefølge af aminosyrerester, der udgør dets sekvens.Med udviklingen af fastfase kemisk syntese har den kemiske syntese af forskellige aktive peptider gjort store fremskridt.På grund af den komplicerede sammensætning af peptidet opnået ved fastfasesyntese bør slutproduktet imidlertid renses ved pålidelige separationsmetoder.De almindeligt anvendte oprensningsmetoder for peptider omfatter ionbytterkromatografi (IEC) og omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC), som har ulemperne ved lav prøvebelastningskapacitet, høje omkostninger til separationsmedier, kompliceret og dyrt separationsudstyr, osv. Til den hurtige oprensning af små molekyle peptider (MW < 1 kDa) blev en vellykket ansøgning tidligere offentliggjort af Santai Technologies, hvor en SepaFlash RP C18 patron blev brugt til hurtig oprensning af thymopentin (TP-5) og målprodukt, der opfylder kravene, blev opnået.
Figur 1. 20 almindelige aminosyrer (gengivet fra www.bachem.com).
Der er 20 slags aminosyrer, der er almindelige i sammensætningen af peptider.Disse aminosyrer kan opdeles i følgende grupper efter deres polaritet og syre-base egenskab: ikke-polære (hydrofob), polær (uladet), sure eller basiske (som vist i figur 1).I en peptidsekvens, hvis aminosyrerne, der udgør sekvensen, for det meste er polære (som markeret med lyserød farve i figur 1), såsom cystein, glutamin, asparagin, serin, threonin, tyrosin osv., kan dette peptid have en stærk polaritet og være meget opløselige i vand.Under oprensningsproceduren for disse stærke polære peptidprøver ved omvendt-fase-kromatografi vil et fænomen kaldet hydrofob fasekollaps forekomme (se en tidligere offentliggjort ansøgningsnotat af Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).Sammenlignet med de almindelige C18-søjler er de forbedrede C18AQ-søjler mest velegnede til oprensning af stærke polære eller hydrofile prøver.I dette indlæg blev et stærkt polært peptid brugt som prøven og oprenset af en C18AQ-søjle.Som et resultat blev målproduktet, der opfylder kravene, opnået og kunne bruges i følgende forskning og udvikling.
| Instrument | SepaBean™maskine 2 | |||
| Patroner | 12 g SepaFlash C18 RP flash-patron (sfærisk silica, 20 - 45 μm, 100 Å, bestillingsnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash-patron (sfærisk silica, 20 - 45 μm, 100 Å, ordrenummer：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Bølgelængde | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobil fase | Opløsningsmiddel A: Vand Opløsningsmiddel B: Acetonitril | |||
| Strømningshastighed | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Indlæsning af prøve | 30 mg | |||
| Gradient | Tid (CV) | Opløsningsmiddel B (%) | Tid (min) | Opløsningsmiddel B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13,0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14,0 | 22 | |
| 19,0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18,0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22,0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Resultater og diskussion
For at sammenligne oprensningsydelsen for den polære peptidprøve mellem almindelig C18-søjle og C18AQ-søjle brugte vi en almindelig C18-søjle til flashoprensning af prøven som en start.Som vist i figur 2, på grund af den hydrofobe fasekollaps af C18-kæderne forårsaget af højt vandigt forhold, blev prøven knap tilbageholdt på den almindelige C18-patron og blev direkte elueret ud af den mobile fase.Som et resultat blev prøven ikke effektivt adskilt og oprenset.
Figur 2. Flashkromatogrammet af prøven på en almindelig C18 patron.
Dernæst brugte vi en C18AQ-søjle til flash-oprensning af prøven.Som vist i figur 3 blev peptidet effektivt tilbageholdt på søjlen og derefter elueret ud.Målproduktet blev separeret fra urenhederne i råprøven og opsamlet.Efter lyofilisering og derefter analyseret ved HPLC, har det oprensede produkt en renhed på 98,2% og kan yderligere anvendes til næste trins forskning og udvikling.
Figur 3. Flashkromatogrammet af prøven på en C18AQ patron.
Som konklusion, SepaFlash C18AQ RP flashpatron kombineret med flashkromatografisystemet SepaBean™maskinen kunne tilbyde en hurtig og effektiv løsning til oprensning af stærke polære eller hydrofile prøver.
Der er en serie af SepaFlash C18AQ RP flash-patroner med forskellige specifikationer fra Santai Technology (som vist i tabel 2).
| Varenummer | Kolonnestørrelse | Strømningshastighed (ml/min) | Maks. Tryk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabel 2. SepaFlash C18AQ RP flash-patroner.Emballagematerialer: Højeffektiv sfærisk C18(AQ)-bundet silica, 20 - 45 μm, 100 Å.
For yderligere information om detaljerede specifikationer for SepaBean™-maskinen, eller bestillingsoplysninger om SepaFlash-seriens flash-patroner, besøg venligst vores hjemmeside.
Indlægstid: 12-okt-2018