Hongcheng Wang, Bo Xu
Application R&D Center
Indledning
I henhold til de relative polariteter i stationær fase og mobil fase kan væskekromatografi opdeles i normal fasekromatografi (NPC) og omvendt fasekromatografi (RPC). For RPC er polariteten i den mobile fase stærkere end den stationære fase. RPC er blevet den mest anvendte i væskekromatografiseparationstilstande på grund af dens høje effektivitet, god opløsning og klar tilbageholdelsesmekanisme. Derfor er RPC velegnet til adskillelse og oprensning af forskellige polære eller ikke-polære forbindelser, herunder alkaloider, kulhydrater, fedtsyrer, steroider, nukleinsyrer, aminosyrer, peptider, proteiner osv. I RPC, den mest anvendte stationære fase er silica gelmatrix, der er bundet med forskellige funktioner, inklusive C18, C8, C8, C4, phenyler, phenyl, der er bundet med forskellige funktioner, inklusive C18, C8, C8, C8, C4, phenyle, phenyl, phenyl, der er bundet med med forskellige funktioner, inklusive C18 C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8, C8. Cyano, amino osv. Blandt disse bundne funktionelle grupper er den mest anvendte C18. Det anslås, at mere end 80% af RPC nu bruger C18 -bundet fase. Derfor er C18-kromatografikolonne blevet en must-have universalkolonne for hvert laboratorium.
Selvom C18 -kolonne kan bruges i en meget bred vifte af applikationer, kan dog for nogle prøver, der er meget polære eller meget hydrofile, almindelige C18 -søjler have problemer, når de bruges til at rense sådanne prøver. I RPC kan de almindeligt anvendte elueringsopløsningsmidler bestilles i henhold til deres polaritet: vand <methanol <acetonitril <ethanol <tetrahydrofuran <isopropanol. For at sikre god tilbageholdelse på søjlen for disse prøver (stærk polær eller meget hydrofil) er den høje andel af det vandige system nødvendigt at blive brugt som den mobile fase. Når man bruger rent vandsystem (inklusive rent vand eller ren saltopløsning) som den mobile fase, har den lange kulstofkæde imidlertid på den stationære fase af C18 -søjlen en tendens til at undgå vandet og blandes med hinanden, hvilket resulterer i et øjeblikkeligt fald i opbevaringskapaciteten i søjlen eller endda ingen tilbageholdelse. Dette fænomen kaldes ”hydrofob fase sammenbrud” (som vist i venstre del af figur 1). Selvom denne situation er reversibel, når søjlen vaskes med organiske opløsningsmidler, såsom methanol eller acetonitril, kan den stadig forårsage skade på søjlen. Derfor er det nødvendigt at forhindre, at denne situation sker.
Figur 1. Det skematiske diagram af de bundne faser på overfladen af silicagel i almindelig C18 -søjle (til venstre) og C18AQ -søjlen (til højre).
For at løse de ovennævnte problemer har de kromatografiske pakningsmaterialer producenter foretaget tekniske forbedringer. En af disse forbedringer er at foretage nogle modifikationer på overfladen af silica -matrixen, såsom introduktion af hydrofile cyano -grupper (som vist i den højre del af figur 1), for at gøre overfladen af silicagelen mere hydrofile. Således kunne C18 -kæderne på silicaoverfladen udvides fuldt ud under stærkt vandige forhold, og den hydrofobe fase -sammenbrud kunne undgås. Disse modificerede C18 -søjler kaldes vandige C18 -søjler, nemlig C18AQ -søjler, som er designet til stærkt vandige elueringsbetingelser og kan tolerere 100% vandigt system. C18AQ-søjler er blevet vidt anvendt i adskillelse og oprensning af stærke polære forbindelser, herunder organiske syrer, peptider, nukleosider og vandopløselige vitaminer.
Afsaltning er en af de typiske anvendelser af C18AQ -søjler i flashoprensningen for prøver, der fjerner salt- eller pufferkomponenterne i prøveopløsningsmidlet for at lette anvendelsen af prøven i efterfølgende undersøgelser. I dette indlæg blev den strålende blå FCF med stærk polaritet anvendt som prøven og oprenset på C18AQ -kolonnen. Prøveopløsningsmidlet blev erstattet af organisk opløsningsmiddel fra pufferopløsning, hvilket letter følgende roterende fordampning såvel som at spare opløsningsmidler og driftstid. Endvidere blev prøvenes renhed forbedret ved at fjerne nogle urenheder i prøven.
Eksperimentel sektion
Figur 2. Den kemiske struktur af prøven.
Den strålende blå FCF blev brugt som prøven i dette indlæg. Renheden af den rå prøve var 86%, og den kemiske struktur af prøven blev vist i figur 2. For at fremstille prøveopløsningen blev 300 mg pulverformet råt fast fast stof af strålende blå FCF opløst i 1 M NAH2PO4 -pufferopløsning og rystede godt for at blive en helt klar opløsning. Prøveopløsningen blev derefter injiceret i flash -søjlen med en injektor. Den eksperimentelle opsætning af flashoprensningen er anført i tabel 1.
| Instrument | Sepabean ™ -maskine2 | |||
| Patroner | 12 g Sepaflash C18 RP Flash Cartridge (sfærisk silica, 20-45 μm, 100 Å, ordrenummer: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridge (sfærisk silica, 20-45 μm, 100 Å, ordrenummer ： SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Bølgelængde | 254 nm | |||
| Mobil fase | Opløsningsmiddel A ： Vand Opløsningsmiddel B ： Methanol | |||
| Strømningshastighed | 30 ml/min | |||
| Prøveindlæsning | 300 mg (strålende blå FCF med renheden på 86%) | |||
| Gradient | Tid (CV) | Opløsningsmiddel B (%) | Tid (CV) | Opløsningsmiddel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultater og diskussion
En Sepaflash C18AQ RP Flash -patron blev anvendt til prøve afsaltning og oprensning. Tringradient blev anvendt, hvor rent vand blev anvendt som den mobile fase i starten af elueringen og kørt i 10 søjlumre (CV). Som vist i figur 3, når man brugte rent vand som den mobile fase, blev prøven fuldstændigt tilbageholdt på flashpatronen. Dernæst blev methanolen i den mobile fase direkte forøget til 100%, og gradienten blev opretholdt for 7,5 CV. Prøven blev elueret ud fra 11,5 til 13,5 cv. I de indsamlede fraktioner blev prøveopløsningen erstattet fra NaH2PO4 -pufferopløsning til methanol. Sammenlignet med meget vandig opløsning var methanol meget lettere at blive fjernet ved roterende fordampning i det efterfølgende trin, hvilket letter følgende forskning.
Figur 3. Flash -kromatogrammet af prøven på en C18AQ -patron.
For at sammenligne opbevaringsadfærden af C18AQ -patron og almindelig C18 -patron til prøver af stærk polaritet blev der udført parallel sammenligningstest. En Sepaflash C18 RP -flashpatron blev anvendt, og flashchromatogrammet til prøven blev vist i figur 4. For almindelige C18 -patroner er det højest tolererede vandige faseforhold ca. 90%. Derfor blev startgradienten sat til 10% methanol i 90% vand. Som vist i figur 4 på grund af den hydrofobe fase sammenbrud af C18 -kæderne forårsaget af højt vandigt forhold blev prøven næppe tilbageholdt på den almindelige C18 -patron og blev direkte elueret ud af den mobile fase. Som et resultat kan driften af afsaltning eller oprensning af prøve ikke afsluttes.
Figur 4. Flash -kromatogrammet af prøven på en almindelig C18 -patron.
Sammenlignet med lineær gradient har brugen af tringradient følgende fordele:
1. opløsningsmiddelforbrug og køretid til prøveoprensning reduceres.
2.. Målproduktet elueres i en skarp top, hvilket reducerer mængden af indsamlede fraktioner og letter således følgende roterende fordampning samt sparende tid.
3.. Det indsamlede produkt er i methanol, som er let at fordampes, og dermed reduceres tørretiden.
Som konklusion til oprensning af prøven, der er stærkt polær eller meget hydrofil, kan Sepaflash C18AQ RP flashpatroner kombineret med det præparative flashchromatografisystem Sepabean ™ -maskine tilbyde en hurtig og effektiv løsning.
Om Sepaflash Bonded Series C18 RP Flash -patroner
Der er en serie af Sepaflash C18AQ RP -flashpatronerne med forskellige specifikationer fra Santai -teknologien (som vist i tabel 2).
| Varenummer | Kolonstørrelse | Strømningshastighed (ml/min) | Max.pressure (Psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabel 2. Sepaflash C18AQ RP Flash -patroner.
Pakningsmaterialer: Højeffektiv sfærisk C18 (aq) -bundet silica, 20-45 μm, 100 Å.
logy (som vist i tabel 2).
Posttid: Aug-27-2018