Hongcheng Wang, Bo Xu
Application R&D Center
Introduktion
Ifølge de relative polariteter af stationær fase og mobil fase kan væskekromatografi opdeles i normal fase kromatografi (NPC) og omvendt fase kromatografi (RPC).For RPC er polariteten af den mobile fase stærkere end den for den stationære fase.RPC er blevet den mest udbredte i væskekromatografiseparationstilstande på grund af dens høje effektivitet, gode opløsning og klare tilbageholdelsesmekanisme.Derfor er RPC velegnet til adskillelse og oprensning af forskellige polære eller ikke-polære forbindelser, herunder alkaloider, kulhydrater, fedtsyrer, steroider, nukleinsyrer, aminosyrer, peptider, proteiner osv. I RPC er den mest almindeligt anvendte stationære fase. silicagelmatrixen, som er bundet med forskellige funktionelle grupper, herunder C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino osv. Blandt disse bundne funktionelle grupper er den mest anvendte C18.Det anslås, at mere end 80% af RPC nu bruger C18 bundet fase.Derfor er C18 kromatografisøjle blevet et must-have universel søjle til ethvert laboratorium.
Selvom C18-søjle kan bruges i en meget bred vifte af applikationer, kan almindelige C18-søjler dog for nogle prøver, som er meget polære eller meget hydrofile, have problemer, når de bruges til at rense sådanne prøver.I RPC kan de almindeligt anvendte elueringsopløsningsmidler bestilles efter deres polaritet: vand < methanol < acetonitril < ethanol < tetrahydrofuran < isopropanol.For at sikre god retention på søjlen for disse prøver (stærk polær eller meget hydrofil), er høj andel af vandigt system nødvendigt for at blive brugt som den mobile fase.Men når man bruger et rent vandsystem (inklusive rent vand eller ren saltopløsning) som den mobile fase, har den lange kulstofkæde på den stationære fase af C18-kolonnen en tendens til at undgå vandet og blande sig med hinanden, hvilket resulterer i et øjeblikkeligt fald i retentionskapacitet af søjlen eller endda ingen retention.Dette fænomen kaldes "hydrofobisk fasekollaps" (som vist i venstre del af figur 1).Selvom denne situation er reversibel, når søjlen vaskes med organiske opløsningsmidler såsom methanol eller acetonitril, kan den stadig forårsage skade på søjlen.Derfor er det nødvendigt at forhindre, at denne situation opstår.
Figur 1. Det skematiske diagram af de bundne faser på overfladen af silicagel i almindelig C18 kolonne (venstre) og C18AQ kolonne (højre).
For at løse de ovennævnte problemer har producenterne af kromatografiske emballagematerialer foretaget tekniske forbedringer.En af disse forbedringer er at lave nogle modifikationer på overfladen af silica-matrixen, såsom introduktionen af hydrofile cyanogrupper (som vist i højre del af figur 1), for at gøre overfladen af silicagelen mere hydrofil.Således kunne C18-kæderne på silicaoverfladen forlænges fuldstændigt under meget vandige betingelser, og den hydrofobe fasekollaps kunne undgås.Disse modificerede C18-søjler kaldes vandige C18-søjler, nemlig C18AQ-søjler, som er designet til stærkt vandige elueringsbetingelser og kan tåle 100 % vandigt system.C18AQ-søjler er blevet brugt i vid udstrækning til adskillelse og oprensning af stærke polære forbindelser, herunder organiske syrer, peptider, nukleosider og vandopløselige vitaminer.
Afsaltning er en af de typiske anvendelser af C18AQ-søjler i flash-oprensningen til prøver, som fjerner salt- eller bufferkomponenterne i prøveopløsningsmidlet for at lette påføringen af prøven i efterfølgende undersøgelser.I dette indlæg blev Brilliant Blue FCF med stærk polaritet brugt som prøven og oprenset på C18AQ-søjlen.Prøveopløsningsmidlet blev erstattet af organisk opløsningsmiddel fra bufferopløsning, hvilket letter den efterfølgende rotationsfordampning samt sparer opløsningsmidler og driftstid.Endvidere blev renheden af prøven forbedret ved at fjerne nogle urenheder i prøven.
forsøgssektionen
Figur 2. Prøvens kemiske struktur.
Brilliant Blue FCF blev brugt som prøven i dette indlæg.Råprøvens renhed var 86 %, og prøvens kemiske struktur blev vist i figur 2. For at fremstille prøveopløsningen blev 300 mg pulverformigt fast stof af Brilliant Blue FCF opløst i 1 M NaH2PO4 bufferopløsning og rystet godt for at blive en helt klar løsning.Prøveopløsningen blev derefter injiceret i flashsøjlen med en injektor.Den eksperimentelle opsætning af flash-rensningen er angivet i tabel 1.
| Instrument | SepaBean™-maskine2 | |||
| Patroner | 12 g SepaFlash C18 RP flash-patron (sfærisk silica, 20 - 45 μm, 100 Å, bestillingsnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash-patron (sfærisk silica, 20 - 45 μm, 100 Å, ordrenummer：SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Bølgelængde | 254 nm | |||
| Mobil fase | Opløsningsmiddel A: Vand Opløsningsmiddel B: Methanol | |||
| Strømningshastighed | 30 ml/min | |||
| Indlæsning af prøve | 300 mg (Brilliant Blue FCF med en renhed på 86%) | |||
| Gradient | Tid (CV) | Opløsningsmiddel B (%) | Tid (CV) | Opløsningsmiddel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultater og diskussion
En SepaFlash C18AQ RP flash-patron blev brugt til prøveafsaltning og rensning.Tringradient blev anvendt, hvor rent vand blev anvendt som den mobile fase ved starten af elueringen og kørt i 10 kolonnevolumener (CV).Som vist i figur 3, ved brug af rent vand som den mobile fase, blev prøven fuldstændig tilbageholdt på flash-patronen.Dernæst blev methanolen i den mobile fase øget direkte til 100%, og gradienten blev opretholdt i 7,5 CV.Prøven blev elueret fra 11,5 til 13,5 CV.I de opsamlede fraktioner blev prøveopløsningen erstattet fra NaH2PO4-bufferopløsning til methanol.Sammenlignet med meget vandig opløsning var methanol meget lettere at fjerne ved rotationsfordampning i det efterfølgende trin, hvilket letter den følgende forskning.
Figur 3. Flashkromatogrammet af prøven på en C18AQ patron.
For at sammenligne tilbageholdelsesadfærden af C18AQ-patron og almindelig C18-patron for prøver med stærk polaritet, blev der udført parallel sammenligningstest.En SepaFlash C18 RP flash-patron blev brugt, og flashkromatogrammet for prøven blev vist i figur 4. For almindelige C18-patroner er det højeste tolererede vandfaseforhold omkring 90 %.Derfor blev startgradienten sat til 10% methanol i 90% vand.Som vist i figur 4, på grund af den hydrofobe fasekollaps af C18-kæderne forårsaget af højt vandigt forhold, blev prøven knap tilbageholdt på den almindelige C18-patron og blev direkte elueret ud af den mobile fase.Som et resultat heraf kan afsaltning eller rensning af prøver ikke fuldføres.
Figur 4. Flashkromatogrammet af prøven på en almindelig C18 patron.
Sammenlignet med lineær gradient har brugen af step gradient følgende fordele:
1. Brug af opløsningsmiddel og køretid til prøverensning reduceres.
2. Målproduktet eluerer i en skarp top, hvilket reducerer volumen af opsamlede fraktioner og dermed letter den efterfølgende rotationsfordampning samt sparer tid.
3. Det opsamlede produkt er i methanol, som er let at fordampe, hvorved tørretiden reduceres.
Som konklusion kan SepaFlash C18AQ RP flash-patroner kombineret med det præparative flashkromatografisystem SepaBean™ Machine tilbyde en hurtig og effektiv løsning til oprensning af prøven, som er stærkt polær eller meget hydrofil.
Om SepaFlash Bonded Series C18 RP flash-patroner
Der er en serie af SepaFlash C18AQ RP flash-patroner med forskellige specifikationer fra Santai Technology (som vist i tabel 2).
| Varenummer | Kolonnestørrelse | Strømningshastighed (ml/min) | Maks. Tryk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabel 2. SepaFlash C18AQ RP flash-patroner.
Emballagematerialer: Højeffektiv sfærisk C18(AQ)-bundet silica, 20 - 45 μm, 100 Å.
logik (som vist i tabel 2).
Indlægstid: 27. august 2018