Rui Huang, Bo Xu
Canolfan Ymchwil a Datblygu Cymwysiadau
Rhagymadrodd
Mae peptid yn gyfansoddyn sy'n cynnwys asidau amino, ac mae gan bob un ohonynt briodweddau ffisegol a chemegol unigryw oherwydd y gwahanol fathau a threfn o weddillion asid amino sy'n ffurfio ei ddilyniant.Gyda datblygiad synthesis cemegol cyfnod solet, mae synthesis cemegol amrywiol peptidau gweithredol wedi gwneud cynnydd mawr.Fodd bynnag, oherwydd cyfansoddiad cymhleth y peptid a geir trwy synthesis cyfnod solet, dylid puro'r cynnyrch terfynol trwy ddulliau gwahanu dibynadwy.Mae'r dulliau puro a ddefnyddir yn gyffredin ar gyfer peptidau yn cynnwys cromatograffaeth cyfnewid ïon (IEC) a chromatograffeg hylif perfformiad uchel cam gwrthdro (RP-HPLC), sydd ag anfanteision gallu llwytho sampl isel, cost uchel cyfryngau gwahanu, offer gwahanu cymhleth a chostus, ac ati Ar gyfer puro peptidau moleciwl bach yn gyflym (MW <1 kDa), cyhoeddwyd achos cais llwyddiannus yn flaenorol gan Santai Technologies, lle defnyddiwyd cetris SepaFlash RP C18 ar gyfer puro thymopentin yn gyflym (TP-5) a'r cafwyd cynnyrch targed yn bodloni'r gofynion.
Ffigur 1. 20 asid amino cyffredin (wedi'u hatgynhyrchu o www.bachem.com).
Mae yna 20 math o asidau amino sy'n gyffredin yng nghyfansoddiad peptidau.Gellir rhannu'r asidau amino hyn yn y grwpiau canlynol yn ôl eu polaredd a'u heiddo asid-sylfaen: amhenodol (hydroffobig), pegynol (heb ei wefru), asidig neu sylfaenol (fel y dangosir yn Ffigur 1).Mewn dilyniant peptid, os yw'r asidau amino sy'n ffurfio'r dilyniant yn rhai pegynol yn bennaf (fel y'u nodir mewn lliw pinc yn Ffigur 1), megis Cysteine, Glutamine, Asparagine, Serine, Threonine, Tyrosine, ac ati, yna gallai fod gan y peptid hwn cryf polaredd a bod yn hydawdd iawn mewn dŵr.Yn ystod y weithdrefn buro ar gyfer y samplau peptid pegynol cryf hyn trwy gromatograffaeth cyfnod gwrthdroi, bydd ffenomen o'r enw cwymp cyfnod hydroffobig yn digwydd (cyfeiriwch at nodyn cais a gyhoeddwyd yn flaenorol gan Santai Technologies: Cwymp Cyfnod Hydroffobig, Colofnau Cromatograffaeth Cyfnod Gwrthdroi AQ a'u Cymwysiadau).O'u cymharu â'r colofnau C18 rheolaidd, mae'r colofnau C18AQ gwell yn fwyaf addas ar gyfer puro samplau pegynol neu hydroffilig cryf.Yn y swydd hon, defnyddiwyd peptid pegynol cryf fel y sampl a'i buro gan golofn C18AQ.O ganlyniad, cafwyd y cynnyrch targed sy'n bodloni'r gofynion a gellid ei ddefnyddio yn yr ymchwil a'r datblygiad canlynol.
| Offeryn | SepaFean™peiriant 2 | |||
| Cetris | Cetris fflach 12 g SepaFlash C18 RP (silica sfferig, 20 - 45 μm, 100 Å, archeb lleian: SW-5222-012-SP) | Cetris fflach 12 g SepaFlash C18AQ RP (silica sfferig, 20 - 45 μm, 100 Å, Rhif archeb: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Tonfedd | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Cyfnod symudol | Hydoddydd A: Dŵr Hydoddydd B: Acetonitrile | |||
| Cyfradd llif | 15 ml/munud | 20 ml/munud | ||
| Llwytho sampl | 30 mg | |||
| graddiant | Amser (CV) | Hydoddydd B (%) | Amser (munud) | Hydoddydd B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Canlyniadau a Thrafodaeth
Er mwyn cymharu perfformiad puro'r sampl peptid pegynol rhwng colofn C18 rheolaidd a cholofn C18AQ, gwnaethom ddefnyddio colofn C18 reolaidd ar gyfer puro'r sampl yn fflach fel cychwyn.Fel y dangosir yn Ffigur 2, oherwydd cwymp cyfnod hydroffobig cadwyni C18 a achosir gan gymhareb ddyfrllyd uchel, prin y cadwyd y sampl ar y cetris C18 rheolaidd ac fe'i dilewyd yn uniongyrchol gan y cyfnod symudol.O ganlyniad, ni chafodd y sampl ei wahanu a'i buro'n effeithiol.
Ffigur 2. Cromatogram fflach y sampl ar cetris C18 rheolaidd.
Nesaf, gwnaethom ddefnyddio colofn C18AQ ar gyfer puro'r sampl yn fflach.Fel y dangosir yn Ffigur 3, roedd y peptid yn cael ei gadw i bob pwrpas ar y golofn ac yna'n cael ei dynnu allan.Cafodd y cynnyrch targed ei wahanu oddi wrth yr amhureddau yn y sampl amrwd a'i gasglu.Ar ôl lyophilization ac yna ei ddadansoddi gan HPLC, mae gan y cynnyrch puro purdeb o 98.2% a gellid ei ddefnyddio ymhellach ar gyfer ymchwil a datblygu cam nesaf.
Ffigur 3. Cromatogram fflach y sampl ar cetris C18AQ.
I gloi, cyfunwyd cetris fflach SepaFlash C18AQ RP â'r system cromatograffaeth fflach SepaBean™gallai peiriant gynnig ateb cyflym ac effeithiol ar gyfer puro samplau pegynol neu hydroffilig cryf.
Mae yna gyfres o cetris fflach SepaFlash C18AQ RP gyda manylebau gwahanol i Santai Technology (fel y dangosir yn Nhabl 2).
| Rhif yr Eitem | Maint Colofn | Cyfradd Llif (mL/munud) | Max.Pwysau (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabl 2. Cetris fflach SepaFlash C18AQ RP.Deunyddiau pacio: Spherical effeithlonrwydd uchel C18(AQ)-bondio silica, 20 - 45 μm, 100 Å.
I gael rhagor o wybodaeth am fanylebau manwl peiriant SepaBean™, neu'r wybodaeth archebu ar cetris fflach cyfres SepaFlash, ewch i'n gwefan.
Amser postio: Hydref-12-2018