Hongcheng Wang, Bo Xu
Canolfan Ymchwil a Datblygu Cymwysiadau
Rhagymadrodd
Yn ôl polareddau cymharol cyfnod llonydd a chyfnod symudol, gellir rhannu cromatograffaeth hylif yn gromatograffaeth cyfnod arferol (NPC) a chromatograffeg cyfnod gwrthdroi (RPC).Ar gyfer RPC, mae polaredd y cyfnod symudol yn gryfach nag un y cyfnod llonydd.RPC yw'r un a ddefnyddir fwyaf mewn dulliau gwahanu cromatograffaeth hylif oherwydd ei effeithlonrwydd uchel, datrysiad da a mecanwaith cadw clir.Felly mae RPC yn addas ar gyfer gwahanu a phuro amrywiol gyfansoddion pegynol neu anpolar, gan gynnwys alcaloidau, carbohydradau, asidau brasterog, steroidau, asidau niwclëig, asidau amino, peptidau, proteinau, ac ati. Yn RPC, y cyfnod llonydd a ddefnyddir amlaf yw y matrics gel silica sydd wedi'i fondio â gwahanol grwpiau swyddogaethol, gan gynnwys C18, C8, C4, ffenyl, cyano, amino, ac ati Ymhlith y grwpiau swyddogaethol bondio hyn, yr un a ddefnyddir fwyaf yw C18.Amcangyfrifir bod mwy nag 80% o RPC bellach yn defnyddio cyfnod bondio C18.Felly mae colofn cromatograffaeth C18 wedi dod yn golofn gyffredinol hanfodol ar gyfer pob labordy.
Er y gellir defnyddio colofn C18 mewn ystod eang iawn o gymwysiadau, fodd bynnag, ar gyfer rhai samplau sy'n begynol iawn neu'n hynod hydroffilig, gall colofnau C18 rheolaidd gael problemau wrth gael eu defnyddio i buro samplau o'r fath.Mewn RPC, gellir archebu'r toddyddion elution a ddefnyddir yn gyffredin yn ôl eu polaredd: dŵr < methanol < acetonitrile < ethanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Er mwyn sicrhau cadw da ar y golofn ar gyfer y samplau hyn (pegynol cryf neu hynod hydroffilig), mae angen defnyddio cyfran uchel o system ddyfrllyd fel y cyfnod symudol.Fodd bynnag, wrth ddefnyddio system dŵr pur (gan gynnwys dŵr pur neu doddiant halen pur) fel y cyfnod symudol, mae'r gadwyn garbon hir ar y cyfnod llonydd o golofn C18 yn tueddu i osgoi'r dŵr a chymysgu â'i gilydd, gan arwain at ostyngiad ar unwaith yn y gallu cadw'r golofn neu hyd yn oed dim cadw.Gelwir y ffenomen hon yn “gwymp cyfnod hydroffobig” (fel y dangosir yn rhan chwith Ffigur 1).Er bod y sefyllfa hon yn gildroadwy pan fydd y golofn yn cael ei golchi â thoddyddion organig fel methanol neu acetonitrile, gall achosi difrod i'r golofn o hyd.Felly, mae angen atal y sefyllfa hon rhag digwydd.
Ffigur 1. Y diagram sgematig o'r cyfnodau bondio ar wyneb gel silica mewn colofn C18 rheolaidd (chwith) a cholofn C18AQ (dde).
Er mwyn mynd i'r afael â'r problemau uchod, mae'r gwneuthurwyr deunyddiau pacio cromatograffig wedi gwneud gwelliannau technegol.Un o'r gwelliannau hyn yw gwneud rhai addasiadau ar wyneb y matrics silica, megis cyflwyno grwpiau cyano hydroffilig (fel y dangosir yn rhan dde Ffigur 1), i wneud wyneb y gel silica yn fwy hydroffilig.Felly gellid ymestyn y cadwyni C18 ar yr wyneb silica yn llawn o dan amodau dyfrllyd iawn a gellid osgoi cwymp y cyfnod hydroffobig.Gelwir y colofnau C18 addasedig hyn yn golofnau C18 dyfrllyd, sef colofnau C18AQ, sydd wedi'u cynllunio ar gyfer amodau elution dyfrllyd iawn ac sy'n gallu goddef system ddyfrllyd 100%.Mae colofnau C18AQ wedi'u cymhwyso'n eang wrth wahanu a phuro cyfansoddion pegynol cryf, gan gynnwys asidau organig, peptidau, niwcleosidau a fitaminau sy'n hydoddi mewn dŵr.
Mae dihalwyno yn un o gymwysiadau nodweddiadol colofnau C18AQ yn y puro fflach ar gyfer samplau, sy'n tynnu'r cydrannau halen neu glustogi yn y toddydd sampl i hwyluso cymhwyso'r sampl mewn astudiaethau dilynol.Yn y swydd hon, defnyddiwyd y Brilliant Blue FCF gyda polaredd cryf fel y sampl a'i buro ar y golofn C18AQ.Disodlwyd y toddydd sampl gan doddydd organig o hydoddiant byffer, gan hwyluso'r anweddiad cylchdro canlynol yn ogystal ag arbed toddyddion ac amser gweithredu.At hynny, gwellwyd purdeb y sampl trwy gael gwared ar rai amhureddau yn y sampl.
Adran Arbrofol
Ffigur 2. Strwythur cemegol y sampl.
Defnyddiwyd y Brilliant Blue FCF fel y sampl yn y swydd hon.Roedd purdeb y sampl crai yn 86% a dangoswyd strwythur cemegol y sampl yn Ffigur 2. Er mwyn paratoi'r ateb sampl, toddwyd 300 mg o solid crai powdrog o Brilliant Blue FCF mewn hydoddiant byffer 1 M NaH2PO4 ac ysgydwodd yn dda i ddod. ateb hollol glir.Yna cafodd yr hydoddiant sampl ei chwistrellu i'r golofn fflach gan chwistrellydd.Mae gosodiad arbrofol y puro fflach wedi'i restru yn Nhabl 1.
| Offeryn | Peiriant SepaBean™2 | |||
| Cetris | 12 g cetris fflach SepaFlash C18 RP (silica sfferig, 20 - 45 μm, 100 Å, Rhif archeb: SW-5222-012-SP) | Cetris fflach 12 g SepaFlash C18AQ RP (silica sfferig, 20 - 45 μm, 100 Å, Rhif archeb: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Tonfedd | 254 nm | |||
| Cyfnod symudol | Hydoddydd A: Dŵr Hydoddydd B: Methanol | |||
| Cyfradd llif | 30 ml/munud | |||
| Llwytho sampl | 300 mg (FFF Glas Gwych gyda phurdeb 86%) | |||
| graddiant | Amser (CV) | Hydoddydd B (%) | Amser (CV) | Hydoddydd B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Canlyniadau a Thrafodaeth
Defnyddiwyd cetris fflach SepaFlash C18AQ RP ar gyfer dihalwyno sampl a phuro.Defnyddiwyd graddiant cam lle defnyddiwyd dŵr pur fel y cyfnod symudol ar ddechrau'r elution a'i redeg am gyfrolau 10 colofn (CV).Fel y dangosir yn Ffigur 3, wrth ddefnyddio dŵr pur fel y cyfnod symudol, cadwyd y sampl yn gyfan gwbl ar y cetris fflach.Nesaf, cynyddwyd y methanol yn y cyfnod symudol yn uniongyrchol i 100% a chynhaliwyd y graddiant ar gyfer 7.5 CV.Cafodd y sampl ei hepgor o 11.5 i 13.5 CV.Yn y ffracsiynau a gasglwyd, disodlwyd yr hydoddiant sampl o hydoddiant byffer NaH2PO4 i fethanol.O gymharu â hydoddiant dyfrllyd iawn, roedd methanol yn llawer haws i'w dynnu trwy anweddiad cylchdro yn y cam dilynol, sy'n hwyluso'r ymchwil ganlynol.
Ffigur 3. Cromatogram fflach y sampl ar cetris C18AQ.
Er mwyn cymharu ymddygiad cadw cetris C18AQ a chetris C18 rheolaidd ar gyfer samplau o bolaredd cryf, perfformiwyd prawf cymhariaeth gyfochrog.Defnyddiwyd cetris fflach SepaFlash C18 RP a dangoswyd y cromatogram fflach ar gyfer y sampl yn Ffigur 4. Ar gyfer cetris C18 rheolaidd, mae'r gymhareb cyfnod dyfrllyd a oddefir uchaf tua 90%.Felly gosodwyd y graddiant cychwyn ar 10% methanol mewn 90% o ddŵr.Fel y dangosir yn Ffigur 4, oherwydd cwymp cyfnod hydroffobig cadwyni C18 a achoswyd gan gymhareb ddyfrllyd uchel, prin y cadwyd y sampl ar y cetris C18 rheolaidd ac fe'i dilewyd yn uniongyrchol gan y cyfnod symudol.O ganlyniad, ni ellir cwblhau gweithrediad dihalwyno sampl neu buro.
Ffigur 4. Cromatogram fflach y sampl ar cetris C18 rheolaidd.
O gymharu â graddiant llinol, mae gan ddefnyddio graddiant cam y manteision canlynol:
1. Mae defnydd toddyddion ac amser rhedeg ar gyfer puro sampl yn cael ei leihau.
2. Mae'r cynnyrch targed yn elutio mewn brig sydyn, sy'n lleihau cyfaint y ffracsiynau a gasglwyd ac felly'n hwyluso'r anweddiad cylchdro canlynol yn ogystal ag arbed amser.
3. Mae'r cynnyrch a gasglwyd mewn methanol sy'n hawdd ei anweddu, felly mae amser sychu yn cael ei leihau.
I gloi, ar gyfer puro'r sampl sy'n begynol iawn neu'n hynod hydroffilig, gallai cetris fflach SepaFlash C18AQ RP sy'n cyfuno â'r system cromatograffaeth fflach paratoadol SepaBean™ Machine gynnig datrysiad cyflym ac effeithlon.
Ynglŷn â'r cetris fflach SepaFlash Bonded Series C18 RP
Mae yna gyfres o cetris fflach SepaFlash C18AQ RP gyda manylebau gwahanol i Santai Technology (fel y dangosir yn Nhabl 2).
| Rhif yr Eitem | Maint Colofn | Cyfradd Llif (mL/munud) | Max.Pwysau (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabl 2. Cetris fflach SepaFlash C18AQ RP.
Deunyddiau pacio: Spherical effeithlonrwydd uchel C18(AQ)-bondio silica, 20 - 45 μm, 100 Å.
logy (fel y dangosir yn Nhabl 2).
Amser post: Awst-27-2018