Hongcheng Wang, Bo Xu
Canolfan Ymchwil a Datblygu cais
Cyflwyniad
Yn ôl polaredd cymharol cyfnod llonydd a chyfnod symudol, gellir rhannu cromatograffeg hylif yn gromatograffeg cyfnod arferol (NPC) a gwrthdroi cromatograffeg cyfnod (RPC). Ar gyfer RPC, mae polaredd y cyfnod symudol yn gryfach nag un y cyfnod llonydd. Mae RPC wedi dod yn un a ddefnyddir fwyaf eang mewn dulliau gwahanu cromatograffeg hylif oherwydd ei effeithlonrwydd uchel, ei ddatrys yn dda a'i fecanwaith cadw clir. Felly mae RPC yn addas ar gyfer gwahanu a phuro amrywiol gyfansoddion pegynol neu nad ydynt yn begyn Phenyl, cyano, amino, ac ati. Ymhlith y grwpiau swyddogaethol hyn sydd wedi'u bondio, yr un a ddefnyddir fwyaf yw C18. Amcangyfrifir bod mwy nag 80% o RPC bellach yn defnyddio Cyfnod wedi'i Bondio C18. Felly mae colofn cromatograffeg C18 wedi dod yn golofn gyffredinol hanfodol ar gyfer pob labordy.
Er y gellir defnyddio colofn C18 mewn ystod eang iawn o gymwysiadau, fodd bynnag, ar gyfer rhai samplau sy'n begynol iawn neu'n hydroffilig iawn, gall colofnau C18 rheolaidd gael problemau wrth gael eu defnyddio i buro samplau o'r fath. Yn RPC, gellir archebu'r toddyddion elution a ddefnyddir yn gyffredin yn ôl eu polaredd: dŵr <methanol <acetonitrile <ethanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Er mwyn sicrhau cadw da ar y golofn ar gyfer y samplau hyn (pegynol cryf neu hydroffilig iawn), mae angen defnyddio cyfran uchel o'r system ddyfrllyd fel y cyfnod symudol. Fodd bynnag, wrth ddefnyddio system dŵr pur (gan gynnwys dŵr pur neu doddiant halen pur) fel y cyfnod symudol, mae'r gadwyn garbon hir ar gyfnod llonydd colofn C18 yn tueddu i osgoi'r dŵr a chymysgu â'i gilydd, gan arwain at ostyngiad ar unwaith yng ngallu cadw'r golofn neu hyd yn oed dim cadw. Gelwir y ffenomen hon yn “cwymp cyfnod hydroffobig” (fel y dangosir yn rhan chwith Ffigur 1). Er bod y sefyllfa hon yn gildroadwy pan fydd y golofn yn cael ei golchi â thoddyddion organig fel methanol neu asetonitrile, gall achosi niwed i'r golofn o hyd. Felly, mae angen atal y sefyllfa hon rhag digwydd.
Ffigur 1. Diagram sgematig y cyfnodau wedi'u bondio ar wyneb gel silica yng ngholofn C18 rheolaidd (chwith) a cholofn C18AQ (dde).
Er mwyn mynd i'r afael â'r problemau uchod, mae'r gwneuthurwyr deunyddiau pacio cromatograffig wedi gwneud gwelliannau technegol. Un o'r gwelliannau hyn yw gwneud rhai addasiadau ar wyneb y matrics silica, megis cyflwyno grwpiau cyano hydroffilig (fel y dangosir yn rhan dde Ffigur 1), i wneud wyneb y gel silica yn fwy hydroffilig. Felly gellid ymestyn y cadwyni C18 ar yr wyneb silica yn llawn o dan amodau dyfrllyd iawn a gellid osgoi cwymp y cyfnod hydroffobig. Gelwir y colofnau C18 wedi'u haddasu hyn yn golofnau C18 dyfrllyd, sef colofnau C18AQ, sydd wedi'u cynllunio ar gyfer amodau elution dyfrllyd iawn ac sy'n gallu goddef system ddyfrllyd 100%. Mae colofnau C18AQ wedi'u cymhwyso'n helaeth wrth wahanu a phuro cyfansoddion pegynol cryf, gan gynnwys asidau organig, peptidau, niwcleosidau a fitaminau sy'n hydoddi mewn dŵr.
Mae dihalwyno yn un o gymwysiadau nodweddiadol colofnau C18AQ yn y puro fflach ar gyfer samplau, sy'n cael gwared ar y cydrannau halen neu glustogi yn y toddydd sampl i hwyluso cymhwysiad y sampl mewn astudiaethau dilynol. Yn y swydd hon, defnyddiwyd y FCF glas gwych gyda pholaredd cryf fel y sampl a'i buro ar y golofn C18AQ. Disodlwyd y toddydd sampl gan doddydd organig o doddiant byffer, gan hwyluso'r anweddiad cylchdro canlynol yn ogystal ag arbed toddyddion ac amser gweithredu. At hynny, gwellwyd purdeb y sampl trwy gael gwared ar rai amhureddau yn y sampl.
Adran arbrofol
Ffigur 2. Strwythur cemegol y sampl.
Defnyddiwyd y FCF glas gwych fel y sampl yn y swydd hon. Purdeb y sampl amrwd oedd 86% a dangoswyd strwythur cemegol y sampl yn Ffigur 2. I baratoi'r toddiant sampl, diddymwyd solid crai powdrog 300 mg o FCF glas gwych mewn toddiant byffer 1 M NAH2PO4 ac ysgydwodd yn dda i ddod yn ddatrysiad cwbl glir. Yna chwistrellwyd yr hydoddiant sampl i'r golofn fflach gan chwistrellwr. Rhestrir setiad arbrofol y puro fflach yn Nhabl 1.
| Offerynnau | Peiriant Sepabean ™2 | |||
| Chetris | 12 g SepaFlash C18 RP Cetris fflach (silica sfferig, 20-45 μm, 100 Å, rhif archeb: SW-5222-012-sp) | 12 G SepFlash C18AQ RP Cetris fflach (silica sfferig, 20-45 μm, 100 Å, rhif archeb ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Donfedd | 254 nm | |||
| Cyfnod Symudol | Toddydd A ： Dŵr Toddydd B ： Methanol | |||
| Cyfradd llif | 30 ml/min | |||
| Llwytho Sampl | 300 mg (FCF glas gwych gyda phurdeb o 86%) | |||
| Ngraddiant | Amser (CV) | Toddydd B (%) | Amser (CV) | Toddydd B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Canlyniadau a thrafodaeth
Defnyddiwyd cetris fflach SepFlash C18AQ RP ar gyfer dihalwyno a phuro sampl. Defnyddiwyd graddiant cam lle defnyddiwyd dŵr pur fel y cyfnod symudol ar ddechrau elution a'i redeg am 10 cyfrol colofn (CV). Fel y dangosir yn Ffigur 3, wrth ddefnyddio dŵr pur fel y cyfnod symudol, cadwyd y sampl yn llwyr ar y cetris fflach. Nesaf, cynyddwyd y methanol yn y cyfnod symudol yn uniongyrchol i 100% a chynhaliwyd y graddiant am 7.5 cv. Cafodd y sampl ei echdynnu allan o 11.5 i 13.5 cv. Yn y ffracsiynau a gasglwyd, disodlwyd yr hydoddiant sampl o doddiant byffer NAH2PO4 i fethanol. O gymharu â datrysiad dyfrllyd iawn, roedd yn haws o lawer cael ei dynnu trwy anweddiad cylchdro yn y cam dilynol, sy'n hwyluso'r ymchwil ganlynol.
Ffigur 3. Cromatogram fflach y sampl ar getris C18AQ.
Er mwyn cymharu ymddygiad cadw cetris C18AQ a chetris C18 rheolaidd ar gyfer samplau o bolaredd cryf, cynhaliwyd prawf cymhariaeth gyfochrog. Defnyddiwyd cetris fflach SepFlash C18 RP a dangoswyd y cromatogram fflach ar gyfer y sampl yn Ffigur 4. Ar gyfer cetris C18 rheolaidd, y gymhareb cyfnod dyfrllyd a oddefir uchaf yw tua 90%. Felly gosodwyd y graddiant cychwyn ar 10% methanol mewn 90% o ddŵr. Fel y dangosir yn Ffigur 4, oherwydd cwymp cyfnod hydroffobig y cadwyni C18 a achoswyd gan gymhareb dyfrllyd uchel, prin y cafodd y sampl ei chadw ar y cetris C18 rheolaidd ac roedd y cyfnod symudol yn ei dynnu allan yn uniongyrchol. O ganlyniad, ni ellir cwblhau gweithrediad difetha sampl neu buro.
Ffigur 4. Cromatogram fflach y sampl ar getris C18 rheolaidd.
O gymharu â graddiant llinol, mae gan y defnydd o raddiant cam y manteision canlynol:
1. Defnydd Toddyddion ac Amser Rhedeg ar gyfer Puro Sampl yn cael ei leihau.
2. Mae'r cynnyrch targed yn elutes mewn uchafbwynt miniog, sy'n lleihau cyfaint y ffracsiynau a gasglwyd ac felly'n hwyluso'r anweddiad cylchdro canlynol yn ogystal ag arbed amser.
3. Mae'r cynnyrch a gasglwyd mewn methanol sy'n hawdd ei anweddu, felly mae'r amser sychu yn cael ei leihau.
I gloi, er mwyn puro'r sampl sy'n gryf yn begynol neu'n hydroffilig iawn, sepaFlash C18AQ RP Flash Cetrision sy'n cyfuno â'r system cromatograffeg fflach paratoadol, gallai peiriant Sepabean ™ gynnig datrysiad cyflym ac effeithlon.
Ynglŷn â'r Cyfres Bondio SepFlash C18 RP Flash Cartridges
Mae yna gyfres o'r cetris fflach SepFlash C18AQ RP gyda manylebau gwahanol o dechnoleg Santai (fel y dangosir yn Nhabl 2).
| Rhif Eitem | Maint colofn | Cyfradd llif (ml/min) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-sp (d) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (d) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-sp (d) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-sp (d) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-sp (d) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (d) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (d) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-sp (d) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabl 2. SepFlash C18AQ RP Cetris fflach.
Deunyddiau pacio: silica wedi'i bondio sfferig c18 (aq), 20-45 μm, 100 Å.
Logy (fel y dangosir yn Nhabl 2).
Amser Post: Awst-27-2018