Rui Huang, Bo Xu
Aplikační R&D Center
Úvod
Iontoměničová chromatografie (IEC) je chromatografická metoda běžně používaná k separaci a čištění sloučenin, které jsou přítomny v iontové formě v roztoku.Podle různých stavů nabití vyměnitelných iontů lze IEC rozdělit na dva typy, kationtoměničovou chromatografii a anexovou chromatografii.Při kationtoměničové chromatografii jsou kyselé skupiny navázány na povrch separačního média.Například kyselina sulfonová (-SO3H) je běžně používaná skupina v silné kationtové výměně (SCX), která disociuje H+ a záporně nabitá skupina -SO3- tak může adsorbovat další kationty v roztoku.Při anexové chromatografii jsou alkalické skupiny navázány na povrch separačního média.Například kvartérní amin (-NR3OH, kde R je uhlovodíková skupina) se obvykle používá při silné aniontové výměně (SAX), která disociuje OH- a kladně nabitá skupina -N+R3 může adsorbovat jiné anionty v roztoku, což vede k aniontu. směnný efekt.
Mezi přírodními produkty přitahují pozornost vědců flavonoidy pro svou roli v prevenci a léčbě kardiovaskulárních onemocnění.Vzhledem k tomu, že molekuly flavonoidů jsou kyselé v důsledku přítomnosti fenolických hydroxylových skupin, je iontoměničová chromatografie alternativní možností kromě konvenční chromatografie na normální fázi nebo chromatografie na reverzní fázi pro separaci a čištění těchto kyselých sloučenin.Ve flash chromatografii je běžně používaným separačním médiem pro iontovou výměnu silikagelová matrice, kde jsou na její povrch navázány iontoměničové skupiny.Nejčastěji používanými způsoby iontové výměny ve flash chromatografii jsou SCX (obvykle skupina kyseliny sulfonové) a SAX (obvykle skupina kvartérního aminu).V dříve publikované aplikační poznámce s názvem „Aplikace SepaFlash Strong kationtoměničových chromatografických kolon při čištění alkalických sloučenin“ od Santai Technologies byly kolony SCX použity pro čištění alkalických sloučenin.V tomto příspěvku byla jako vzorek použita směs neutrálních a kyselých standardů ke zkoumání použití kolon SAX při čištění kyselých sloučenin.
experimentální sekce
Obrázek 1. Schematický diagram stacionární fáze navázané na povrch separačního média SAX.
V tomto příspěvku byla použita kolona SAX předem naplněná oxidem křemičitým vázaným kvartérním aminem (jak je znázorněno na obrázku 1).Směs chromonu a kyseliny 2,4-dihydroxybenzoové byla použita jako vzorek k čištění (jak je znázorněno na obrázku 2).Směs byla rozpuštěna v methanolu a vložena do flash patrony pomocí injektoru.Experimentální nastavení bleskového čištění je uvedeno v tabulce 1.
Obrázek 2. Chemická struktura dvou složek ve směsi vzorku.
| Nástroj | Stroj SepaBean™ T | |||||
| Kazety | 4g flash cartridge SepaFlash Standard Series (nepravidelný oxid křemičitý, 40 - 63 μm, 60 Å, Objednací číslo: S-5101-0004) | 4g flash cartridge SepaFlash Bonded Series SAX (nepravidelný oxid křemičitý, 40 - 63 μm, 60 Å, Objednací číslo：SW-5001-004-IR) | ||||
| Vlnová délka | 254 nm (detekce), 280 nm (monitorování) | |||||
| Mobilní fáze | Rozpouštědlo A: N-hexan | |||||
| Rozpouštědlo B: Ethylacetát | ||||||
| Průtok | 30 ml/min | 20 ml/min | ||||
| Načítání vzorku | 20 mg (směs složky A a složky B) | |||||
| Spád | čas (CV) | rozpouštědlo B (%) | čas (CV) | rozpouštědlo B (%) | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 1.7 | 12 | 14 | 100 | |||
| 3.7 | 12 | / | / | |||
| 16 | 100 | / | / | |||
| 18 | 100 | / | / | |||
Výsledky a diskuse
Nejprve se směs vzorku oddělila pomocí flash patrony s normální fází předem naplněné běžným oxidem křemičitým.Jak je znázorněno na obrázku 3, dvě složky ve vzorku byly eluovány z kazety jedna po druhé.Dále byla pro čištění vzorku použita flash cartridge SAX.Jak ukazuje obrázek 4, kyselá složka B byla zcela zadržena na patroně SAX.Neutrální složka A byla postupně eluována z patrony elucí mobilní fáze.
Obrázek 3. Bleskový chromatogram vzorku na běžné patroně s normální fází.
Obrázek 4. Bleskový chromatogram vzorku na kazetě SAX.
Ve srovnání s obrázkem 3 a obrázkem 4 má složka A nekonzistentní tvar vrcholu na dvou různých flash kazetách.Pro potvrzení, zda eluční pík odpovídá komponentě, můžeme využít funkci skenování s plnou vlnovou délkou, která je zabudována do řídicího softwaru stroje SepaBean™.Otevřete experimentální data dvou separací, přetáhněte na indikační čáru na časové ose (CV) v chromatogramu do nejvyššího bodu a druhého nejvyššího bodu elučního píku odpovídajícího Složce A a celého spektra vlnové délky těchto dvou body se automaticky zobrazí pod chromatogramem (jak je znázorněno na obrázku 5 a obrázku 6).Při porovnání údajů o spektru celé vlnové délky těchto dvou separací má složka A konzistentní absorpční spektrum ve dvou experimentech.Z důvodu, že složka A má nekonzistentní tvar píku na dvou různých flash kazetách, spekuluje se, že ve složce A je specifická nečistota, která má rozdílnou retenci na kazetě s normální fází a kazetě SAX.Proto je eluční sekvence pro složku A a nečistotu na těchto dvou flash kazetách odlišná, což má za následek nekonzistentní tvar píku na chromatogramech.
Obrázek 5. Spektrum celé vlnové délky komponenty A a nečistoty oddělené kazetou s normální fází.
Obrázek 6. Spektrum celé vlnové délky komponenty A a nečistoty oddělené kazetou SAX.
Pokud je cílovým produktem, který má být sebrán, neutrální složka A, lze purifikační úkol snadno dokončit přímým použitím patrony SAX pro eluci po nanesení vzorku.Na druhou stranu, pokud je cílovým produktem, který má být sebrán, kyselá složka B, způsob zachycení-uvolnění by mohl být přijat pouze s mírnou úpravou v experimentálních krocích: když byl vzorek vložen na kazetu SAX a neutrální složka A byl zcela eluován organickými rozpouštědly s normální fází, přepněte mobilní fázi na roztok methanolu obsahující 5% kyselinu octovou.Acetátové ionty v mobilní fázi budou soutěžit se složkou B o navázání na kvartérní aminové iontové skupiny na stacionární fázi patrony SAX, čímž dojde k eluci složky B z patrony k získání cílového produktu.Chromatogram vzorku separovaného v režimu iontové výměny je znázorněn na obrázku 7.
Obrázek 7. Bleskový chromatogram složky B eluované v režimu iontové výměny na kazetě SAX.
Závěrem lze říci, že kyselý nebo neutrální vzorek by mohl být rychle purifikován kazetou SAX v kombinaci s kazetou s normální fází za použití různých purifikačních strategií.Navíc s pomocí funkce skenování plné vlnové délky zabudované do řídicího softwaru stroje SepaBean™ bylo možné charakteristické absorpční spektrum eluovaných frakcí snadno porovnat a potvrdit, což výzkumníkům pomáhá rychle určit složení a čistotu eluovaných frakcí, a tím zlepšit efektivitu práce.
| Číslo položky | Velikost sloupce | Průtok (ml/min) | Max.tlak (psi/bar) |
| SW-5001-004-IR | 5,9 g | 10-20 | 400/27.5 |
| SW-5001-012-IR | 23 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5001-025-IR | 38 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5001-040-IR | 55 g | 20-40 | 400/27.5 |
| SW-5001-080-IR | 122 g | 30-60 | 350/24,0 |
| SW-5001-120-IR | 180 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5001-220-IR | 340 g | 50-100 | 300/20.7 |
| SW-5001-330-IR | 475 g | 50-100 | 250/17.2
|
Tabulka 2. Flash kazety SepaFlash Bonded Series SAX.Obalové materiály: Ultračistý nepravidelný oxid křemičitý vázaný SAX, 40 - 63 μm, 60 Å.
Další informace o podrobných specifikacích SepaBean™zařízení nebo informace o objednání flashových kazet řady SepaFlash naleznete na našich webových stránkách.
Čas odeslání: List-09-2018