Rui Huang, Bo Xu
Centrum výzkumu a vývoje aplikace
Zavedení
Chromatografie iontové výměny (IEC) je chromatografická metoda, která se běžně používá k oddělení a čištění sloučenin, které jsou prezentovány v iontové formě v roztoku. Podle různých stavů nabití vyměnitelných iontů lze IEC rozdělit na dva typy, chromatografii pro výměnu kationtu a chromatografii aniontu. V chromatografii na výměně kationtu jsou kyselé skupiny spojeny s povrchem separačního média. Například kyselina sulfonová (-so3H) je běžně používanou skupinou při silné výměně kationtu (SCX), která disociační H+ a negativně nabitá skupina -SO3- tedy může adsorbovat jiné kationty v roztoku. V chromatografii Aniontové výměny jsou alkalické skupiny spojeny s povrchem separačního média. Například kvartérní amin (-nr3oh, kde R je uhlovodíková skupina), se obvykle používá při silné aniontové výměně (SAX), která disociační OH- a pozitivně nabitá skupina -N+R3 může adsorbuje jiné anionty v roztoku, což vede k účinku aniontové výměny.
Mezi přírodními produkty přitahovaly flavonoidy pozornost vědců kvůli jejich roli v prevenci a léčbě kardiovaskulárních onemocnění. Protože molekuly flavonoidů jsou kyselé kvůli přítomnosti fenolických hydroxylových skupin, chromatografie iontu je alternativní možností kromě konvenční normální fáze nebo obrácené fázové chromatografie pro separaci a čištění těchto kyselých sloučenin. V chromatografii Flash je běžně používaným separačním médiem pro iontovou výměnu matice silikagelu, kde jsou skupiny iontových výměn spojeny s jeho povrchem. Nejčastěji používanými režimy výměny iontu v chromatografii Flash jsou SCX (obvykle skupina kyseliny sulfonové) a saxová (obvykle kvartérní aminová skupina). V dříve publikované poznámce k aplikaci s názvem „Aplikace sepaflash silná kationtová výměnná chromatografická sloupce při čištění alkalických sloučenin“ Santai Technologies byly sloupce SCX použity pro čištění alkalických sloučenin. V tomto příspěvku byla jako vzorek použita směs neutrálních a kyselých standardů k prozkoumání aplikace SAX sloupců při čištění kyselých sloučenin.
Experimentální část
Obrázek 1.. Schematický diagram stacionární fáze spojený s povrchem saxových separačních médií.
V tomto příspěvku byl použit sloupec SAX předem nabitý kvartérním aminem vázaným oxidem křemičitým (jak je znázorněno na obrázku 1). Jako vzorek k čištění (jak je znázorněno na obrázku 2), byla použita směs chromonu a 2,4-dihydroxybenzoové kyseliny (jak je znázorněno na obrázku 2). Směs byla rozpuštěna v methanolu a nanesena na flash kazetu injektorem. Experimentální nastavení čištění blesku je uvedeno v tabulce 1.
Obrázek 2. Chemická struktura obou složek ve směsi vzorku.
| Nástroj | SEPABEAN ™ Machine t | |||||
| Kazety | 4 g sepaflash standardní série Flash Cartridge (nepravidelný oxid křemičitý, 40-63 μm, 60 Á, číslo objednávky: S-5101-0004) | 4 g sepaflash série série Sax Flash Cartridge (nepravidelný oxid křemičitý, 40-63 μm, 60 Á, číslo objednávky ： SW-5001-004-IR) | ||||
| Vlnová délka | 254 nm (detekce), 280 nm (monitorování) | |||||
| Mobilní fáze | Rozpouštědlo A: n-hexan | |||||
| Rozpouštědlo B: Ethylacetát | ||||||
| Průtok | 30 ml/min | 20 ml/min | ||||
| Načítání vzorku | 20 mg (směs komponenty A a komponenta B) | |||||
| Gradient | Čas (CV) | Rozpouštědlo B (%) | Čas (CV) | Rozpouštědlo B (%) | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 1.7 | 12 | 14 | 100 | |||
| 3.7 | 12 | / | / | |||
| 16 | 100 | / | / | |||
| 18 | 100 | / | / | |||
Výsledky a diskuse
Za prvé, směs vzorku byla oddělena normální fázovou flash kazetou předem zabalenou pravidelným oxidem křemičitým. Jak je znázorněno na obrázku 3, dvě složky ve vzorku byly eluovány z kazety jeden po druhém. Dále byla pro čištění vzorku použita saxová flash kazeta. Jak je znázorněno na obrázku 4, kyselá složka B byla zcela zadržena na saxové kazetě. Neutrální složka A byla postupně eluována z kazety elucí mobilní fáze.
Obrázek 3. Flash chromatogram vzorku na pravidelné normální fázové kazetě.
Obrázek 4. Flash chromatogram vzorku na saxonové kazetě.
Při porovnání obrázku 3 a obrázku 4 má složka A nekonzistentní tvar píku na dvou různých bleskových kazetách. Abychom potvrdili, zda eluční vrchol odpovídá komponentu, můžeme využít funkci skenování plné vlnové délky, která je zabudována do řídicího softwaru stroje Sepabean ™. Otevřete experimentální data obou separací, přetažení na linii indikátoru na časové osy (CV) v chromatogramu do nejvyššího bodu a druhého nejvyššího bodu elučního píku odpovídající komponentě A a spektrum plné vlnové délky těchto dvou bodů bude uvedeno pod chromatogramem (jak je znázorněno na obrázku 5 a obrázek 6). Při porovnání dat spektra plné vlnové délky těchto dvou separací má složka A konzistentní absorpční spektrum ve dvou experimentech. Z důvodu komponenty A má nekonzistentní tvar píku na dvou různých flashských kazetách, je spekulováno, že ve složce A je specifická nečistota, která má odlišnou retenci na normální fázové kazetě a saxologické kazetě. Eluční sekvence je proto odlišná pro komponentu A a nečistotu těchto dvou flash kazet, což má za následek nekonzistentní tvar píku na chromatogramech.
Obrázek 5. Spektrum plné vlnové délky složky A a nečistota oddělená normální fázovou kazetou.
Obrázek 6. Spektrum plné vlnové délky složky A a nečistoty oddělená saxovou kazetou.
Pokud je cílový produkt, který má být shromážděn, je neutrální složka A, čisticí úloha lze snadno dokončit přímo pomocí saxové kazety pro eluce po zatížení vzorku. Na druhé straně, pokud je cílovým produktem, který má být shromážděn, je kyselá složka B, způsob uvolňování zachycení by mohl být přijat pouze s mírným nastavením experimentálních kroků: když byl vzorek naložen na saxovou kazetu a neutrální složka A byla zcela eluována s normální fázovou organickou rozpouštědly, které mobilní fázi obsahují 5% kyselinu okusovou kyselinu. Ionty acetátu v mobilní fázi budou soutěžit se složkou B o vazbu na kvartérní aminovou iontovou skupinu na stacionární fázi saxové kazety, čímž se elují složku B z kazety, aby získaly cílový produkt. Chromatogram vzorku odděleného v režimu výměny iontu byl znázorněn na obrázku 7.
Obrázek 7. Flash chromatogram složky B eluoval v režimu výměny iontu na saxologické kazetě.
Závěrem lze říci, že kyselý nebo neutrální vzorek by mohl být rychle purifikován saxovou kazetou v kombinaci s normální fázovou kazetou pomocí různých strategií čištění. Kromě toho, s pomocí plného skenovacího funkce zabudovaného do řídicího softwaru SEPABEAN ™ Machine, lze charakteristické absorpční spektrum eluovaných frakcí snadno porovnávat a potvrdit, což vědcům pomohlo rychle určit složení a čistotu eluovaných frakcí, a tím zlepšit účinnost práce.
| Číslo položky | Velikost sloupce | Průtok (ML/min) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5001-004-IR | 5,9 g | 10-20 | 400/27,5 |
| SW-5001-012-IR | 23 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5001-025-IR | 38 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5001-040-IR | 55 g | 20-40 | 400/27,5 |
| SW-5001-080-IR | 122 g | 30-60 | 350/24,0 |
| SW-5001-120-IR | 180 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5001-220-IR | 340 g | 50-100 | 300/20,7 |
| SW-5001-330-IR | 475 g | 50-100 | 250/17.2
|
Tabulka 2. Sepaflash spojované série Sax Flash Cartridges. Balicí materiály: Ultraparetní nepravidelný oxid křemičitý saxonový vázaný, 40-63 μm, 60 Á.
Další informace o podrobných specifikacích SEPABEAN ™Machine nebo informace o objednávkách o flash kazet Sepaflash série, navštivte naši webovou stránku.
Čas příspěvku: Nov-09-2018