Rui Huang, Bo Xu
Aplikační R&D Center
Úvod
Peptid je sloučenina složená z aminokyselin, z nichž každá má jedinečné fyzikální a chemické vlastnosti v důsledku různých typů a pořadí aminokyselinových zbytků tvořících jeho sekvenci.S rozvojem chemické syntézy na pevné fázi udělala chemická syntéza různých aktivních peptidů velký pokrok.Avšak vzhledem ke komplikovanému složení peptidu získaného syntézou na pevné fázi by měl být konečný produkt čištěn spolehlivými separačními metodami.Mezi běžně používané purifikační metody pro peptidy patří iontoměničová chromatografie (IEC) a vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC), jejichž nevýhodou je nízká kapacita nanášení vzorku, vysoká cena separačních médií, komplikované a nákladné separační zařízení, vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC). atd. Pro rychlou purifikaci peptidů s malou molekulou (MW < 1 kDa) byl dříve publikován úspěšný případ aplikace Santai Technologies, ve kterém byla kazeta SepaFlash RP C18 použita pro rychlou purifikaci thymopentinu (TP-5) a byl získán cílový produkt splňující požadavky.
Obrázek 1. 20 běžných aminokyselin (převzato z www.bachem.com).
Existuje 20 druhů aminokyselin, které jsou běžné ve složení peptidů.Tyto aminokyseliny lze rozdělit do následujících skupin podle jejich polarity a acidobazické vlastnosti: nepolární (hydrofobní), polární (nenabité), kyselé nebo bazické (jak je znázorněno na obrázku 1).Pokud jsou v peptidové sekvenci aminokyseliny tvořící sekvenci většinou polární (jak je na obrázku 1 vyznačeno růžovou barvou), jako je cystein, glutamin, asparagin, serin, threonin, tyrosin atd., může mít tento peptid silnou polarita a jsou vysoce rozpustné ve vodě.Během purifikace těchto vzorků silných polárních peptidů pomocí chromatografie na reverzní fázi dojde k jevu zvanému kolaps hydrofobní fáze (viz dříve publikovaná aplikační poznámka od Santai Technologies: Hydrofobní Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).Ve srovnání s běžnými kolonami C18 jsou vylepšené kolony C18AQ nejvhodnější pro čištění silně polárních nebo hydrofilních vzorků.V tomto příspěvku byl jako vzorek použit silný polární peptid a purifikován na koloně C18AQ.V důsledku toho byl získán cílový produkt splňující požadavky a mohl být použit v následujícím výzkumu a vývoji.
| Nástroj | SepaBean™stroj 2 | |||
| Kazety | 12g flash cartridge SepaFlash C18 RP (kulatý oxid křemičitý, 20 - 45 μm, 100 Å, objednací číslo: SW-5222-012-SP) | 12g flash cartridge SepaFlash C18AQ RP (kulatý oxid křemičitý, 20 - 45 μm, 100 Å, Objednací číslo：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Vlnová délka | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobilní fáze | Rozpouštědlo A: Voda Rozpouštědlo B: acetonitril | |||
| Průtok | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Načítání vzorku | 30 mg | |||
| Spád | čas (CV) | rozpouštědlo B (%) | čas (min) | rozpouštědlo B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1,0 | 0 | 1,0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13,0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20,0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Výsledky a diskuse
Pro srovnání účinnosti čištění polárního peptidového vzorku mezi běžnou kolonou C18 a kolonou C18AQ jsme jako začátek použili běžnou kolonu C18 pro rychlé čištění vzorku.Jak je znázorněno na obrázku 2, v důsledku kolapsu hydrofobní fáze řetězců C18 způsobeného vysokým poměrem vody byl vzorek stěží zadržen na běžné patroně C18 a byl přímo eluován mobilní fází.V důsledku toho nebyl vzorek účinně separován a čištěn.
Obrázek 2. Bleskový chromatogram vzorku na běžné kazetě C18.
Dále jsme použili kolonu C18AQ pro rychlé čištění vzorku.Jak je znázorněno na obrázku 3, peptid byl účinně zadržen na koloně a poté eluován.Cílový produkt byl oddělen od nečistot v surovém vzorku a shromážděn.Po lyofilizaci a následné analýze pomocí HPLC má vyčištěný produkt čistotu 98,2 % a mohl by být dále použit pro další krok výzkumu a vývoje.
Obrázek 3. Bleskový chromatogram vzorku na kazetě C18AQ.
Závěrem lze říci, že SepaFlash C18AQ RP flash cartridge kombinovaná s flash chromatografickým systémem SepaBean™Stroj by mohl nabídnout rychlé a efektivní řešení pro čištění silných polárních nebo hydrofilních vzorků.
Existuje řada bleskových kazet SepaFlash C18AQ RP s různými specifikacemi od Santai Technology (jak je uvedeno v tabulce 2).
| Číslo položky | Velikost sloupce | Průtok (ml/min) | Max.tlak (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabulka 2. Bleskové kazety SepaFlash C18AQ RP.Obalové materiály: Vysoce účinný sférický C18(AQ) vázaný oxid křemičitý, 20 - 45 μm, 100 Å.
Další informace o podrobných specifikacích stroje SepaBean™ nebo informace o objednání flashových kazet řady SepaFlash naleznete na našich webových stránkách.
Čas odeslání: 12. října 2018