Hongcheng Wang, Bo Xu
Aplikační R&D Center
Úvod
Podle relativní polarity stacionární fáze a mobilní fáze lze kapalinovou chromatografii rozdělit na chromatografii s normální fází (NPC) a chromatografii na reverzní fázi (RPC).U RPC je polarita mobilní fáze silnější než polarita stacionární fáze.RPC se stal nejpoužívanějším v separačních režimech kapalinové chromatografie díky své vysoké účinnosti, dobrému rozlišení a jasnému retenčnímu mechanismu.Proto je RPC vhodný pro separaci a čištění různých polárních nebo nepolárních sloučenin, včetně alkaloidů, sacharidů, mastných kyselin, steroidů, nukleových kyselin, aminokyselin, peptidů, proteinů atd. V RPC je nejčastěji používaná stacionární fáze silikagelová matrice, která je vázána různými funkčními skupinami, včetně C18, C8, C4, fenylu, kyano, amino atd. Mezi těmito vázanými funkčními skupinami je nejpoužívanější C18.Odhaduje se, že více než 80 % RPC nyní používá C18 vázanou fázi.Proto se chromatografická kolona C18 stala nezbytnou univerzální kolonou pro každou laboratoř.
Přestože kolona C18 může být použita ve velmi širokém rozsahu aplikací, u některých vzorků, které jsou velmi polární nebo vysoce hydrofilní, mohou mít běžné kolony C18 problémy při použití k čištění takových vzorků.V RPC lze běžně používaná eluční rozpouštědla seřadit podle jejich polarity: voda < methanol < acetonitril < ethanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Pro zajištění dobré retence na koloně pro tyto vzorky (silně polární nebo vysoce hydrofilní) je nutné použít jako mobilní fázi vysoký podíl vodného systému.Při použití systému čisté vody (včetně čisté vody nebo čistého solného roztoku) jako mobilní fáze má však dlouhý uhlíkový řetězec na stacionární fázi kolony C18 tendenci vyhýbat se vodě a vzájemně se mísit, což má za následek okamžité snížení retenční kapacita kolony nebo dokonce žádná retence.Tento jev se nazývá „kolaps hydrofobní fáze“ (jak je znázorněno v levé části obrázku 1).I když je tato situace reverzibilní, když se kolona promyje organickými rozpouštědly, jako je methanol nebo acetonitril, stále může způsobit poškození kolony.Proto je nutné této situaci zabránit.
Obrázek 1. Schematický diagram navázaných fází na povrchu silikagelu v běžné koloně C18 (vlevo) a koloně C18AQ (vpravo).
K vyřešení výše uvedených problémů provedli výrobci chromatografických balicích materiálů technická vylepšení.Jedním z těchto zlepšení je provedení některých úprav na povrchu silikagelové matrice, jako je zavedení hydrofilních kyanoskupin (jak je znázorněno v pravé části obrázku 1), aby byl povrch silikagelu hydrofilnější.Řetězce C18 na povrchu oxidu křemičitého by tedy mohly být plně prodlouženy za vysoce vodných podmínek a mohlo by se zabránit kolapsu hydrofobní fáze.Tyto modifikované C18 kolony se nazývají vodné C18 kolony, konkrétně kolony C18AQ, které jsou navrženy pro vysoce vodné eluční podmínky a mohou tolerovat 100% vodný systém.Kolony C18AQ byly široce používány při separaci a čištění silných polárních sloučenin, včetně organických kyselin, peptidů, nukleosidů a vitamínů rozpustných ve vodě.
Odsolování je jednou z typických aplikací kolon C18AQ při bleskové purifikaci vzorků, která odstraňuje soli nebo složky pufru v rozpouštědle vzorku, aby se usnadnila aplikace vzorku v následných studiích.V tomto příspěvku byl jako vzorek použit Brilliant Blue FCF se silnou polaritou a purifikován na koloně C18AQ.Rozpouštědlo vzorku bylo nahrazeno organickým rozpouštědlem z roztoku pufru, čímž se usnadnilo následující rotační odpařování a také se ušetřila rozpouštědla a provozní doba.Čistota vzorku byla dále zlepšena odstraněním některých nečistot ve vzorku.
experimentální sekce
Obrázek 2. Chemická struktura vzorku.
Brilliant Blue FCF byl použit jako vzorek v tomto příspěvku.Čistota surového vzorku byla 86 % a chemická struktura vzorku je znázorněna na obrázku 2. K přípravě roztoku vzorku se 300 mg práškové surové pevné látky Brilliant Blue FCF rozpustilo v 1 M roztoku pufru NaH2PO4 a dobře se protřepalo, aby zcela jasné řešení.Roztok vzorku byl poté vstřikován do flash kolony injektorem.Experimentální nastavení bleskového čištění je uvedeno v tabulce 1.
| Nástroj | Stroj SepaBean™2 | |||
| Kazety | 12g flash cartridge SepaFlash C18 RP (kulatý oxid křemičitý, 20 - 45 μm, 100 Å, Objednací číslo: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash cartridge (kulatý oxid křemičitý, 20 - 45 μm, 100 Å, Objednací číslo：SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Vlnová délka | 254 nm | |||
| Mobilní fáze | Rozpouštědlo A: Voda Rozpouštědlo B: Metanol | |||
| Průtok | 30 ml/min | |||
| Načítání vzorku | 300 mg (Brilliant Blue FCF s čistotou 86 %) | |||
| Spád | čas (CV) | rozpouštědlo B (%) | čas (CV) | rozpouštědlo B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Výsledky a diskuse
Pro odsolování a čištění vzorků byla použita flash cartridge SepaFlash C18AQ RP.Použil se stupňovitý gradient, ve kterém byla jako mobilní fáze na začátku eluce použita čistá voda a probíhalo pro 10 objemů kolony (CV).Jak je znázorněno na obrázku 3, při použití čisté vody jako mobilní fáze byl vzorek zcela zadržen na flash kazetě.Dále byl methanol v mobilní fázi přímo zvýšen na 100 % a gradient byl udržován po dobu 7,5 CV.Vzorek byl eluován z 11,5 až 13,5 CV.Ve shromážděných frakcích byl roztok vzorku nahrazen roztokem pufru NaH2P04 za methanol.Ve srovnání s vysoce vodným roztokem bylo mnohem snazší odstranit methanol rotačním odpařováním v následujícím kroku, což usnadňuje následující výzkum.
Obrázek 3. Bleskový chromatogram vzorku na kazetě C18AQ.
Pro srovnání retenčního chování kazety C18AQ a běžné kazety C18 pro vzorky se silnou polaritou byl proveden paralelní srovnávací test.Byla použita blesková kazeta SepaFlash C18 RP a bleskový chromatogram pro vzorek byl znázorněn na obrázku 4. U běžných kazet C18 je nejvyšší tolerovaný poměr vodné fáze přibližně 90 %.Proto byl počáteční gradient nastaven na 10 % methanolu v 90 % vody.Jak je znázorněno na obrázku 4, v důsledku kolapsu hydrofobní fáze řetězců C18 způsobeného vysokým poměrem vody se vzorek stěží zachytil na běžné patroně C18 a byl přímo eluován mobilní fází.V důsledku toho nelze dokončit operaci odsolování nebo čištění vzorku.
Obrázek 4. Bleskový chromatogram vzorku na běžné kazetě C18.
Ve srovnání s lineárním gradientem má použití krokového gradientu následující výhody:
1. Spotřeba rozpouštědla a doba běhu pro čištění vzorku je snížena.
2. Cílový produkt se eluuje v ostrém píku, což snižuje objem shromážděných frakcí a usnadňuje tak následující rotační odpařování a zároveň šetří čas.
3. Sebraný produkt je v methanolu, který lze snadno odpařit, čímž se zkrátí doba sušení.
Závěrem lze říci, že pro čištění vzorku, který je silně polární nebo vysoce hydrofilní, mohou bleskové kazety SepaFlash C18AQ RP v kombinaci se systémem preparativní flash chromatografie SepaBean™ Machine nabídnout rychlé a účinné řešení.
O flash kazetách SepaFlash Bonded Series C18 RP
Existuje řada bleskových kazet SepaFlash C18AQ RP s různými specifikacemi od Santai Technology (jak je uvedeno v tabulce 2).
| Číslo položky | Velikost sloupce | Průtok (ml/min) | Max.tlak (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabulka 2. Bleskové kazety SepaFlash C18AQ RP.
Obalové materiály: Vysoce účinný sférický C18(AQ) vázaný oxid křemičitý, 20 - 45 μm, 100 Å.
logiky (jak je uvedeno v tabulce 2).
Čas odeslání: 27. srpna 2018