Hongcheng Wang, Bo Xu
Centrum výzkumu a vývoje aplikace
Zavedení
Podle relativní polarity stacionární fáze a mobilní fáze lze kapalinovou chromatografii rozdělit do normální fázové chromatografie (NPC) a obrácené fázové chromatografie (RPC). U RPC je polarita mobilní fáze silnější než polažebná fáze stacionární fáze. RPC se stal nejčastěji používaným v režimech separace chromatografie s kapalinovou chromatografií díky své vysoké účinnosti, dobrému rozlišení a jasnému retenčnímu mechanismu. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, cyano, Amino atd. Mezi těmito vázanými funkčními skupinami je nejčastěji používaný C18. Odhaduje se, že více než 80% RPC nyní používá fázi vázané na C18. Proto se chromatografický sloupec C18 stal nezbytným univerzálním sloupcem pro každou laboratoř.
Přestože však sloupec C18 může být použit ve velmi širokém rozsahu aplikací, u některých vzorků, které jsou velmi polární nebo vysoce hydrofilní, mohou mít běžné sloupce C18 problémy při použití k čištění těchto vzorků. V RPC lze běžně používaná eluční rozpouštědla objednat podle jejich polarity: voda <methanol <acetonitril <ethanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Aby se zajistilo dobrou retenci ve sloupci pro tyto vzorky (silné polární nebo vysoce hydrofilní), je třeba jako mobilní fáze použít vysoký podíl vodného systému. Při použití systému čisté vody (včetně čisté vody nebo roztoku čistého soli) však jako mobilní fáze jako mobilní fáze má dlouhý uhlíkový řetězec ve stacionární fázi sloupce C18 vyhýbat se vodě a vzájemně se promíchat, což vede k okamžitému snížení retenční kapacity sloupce nebo dokonce zadržování. Tento jev se nazývá „hydrofobní fázový kolaps“ (jak je znázorněno v levé části obrázku 1). Ačkoli je tato situace reverzibilní, když je sloupec promyta organickými rozpouštědly, jako je methanol nebo acetonitril, stále může způsobit poškození sloupce. Proto je nutné zabránit této situaci.
Obrázek 1.. Schematický diagram vázaných fází na povrchu silikagelu v běžném sloupci C18 (vlevo) a sloupci C18AQ (vpravo).
Pro řešení výše uvedených problémů provedli výrobci chromatografických balicích materiálů technická vylepšení. Jedním z těchto vylepšení je provádět určité úpravy na povrchu siliky matrice, jako je zavedení hydrofilních kyanových skupin (jak je ukázáno ve správné části obrázku 1), aby byl povrch silikagelu více hydrofilní. Řetězy C18 na povrchu oxidu křemičitého by tedy mohly být plně rozšířeny za vysoce vodných podmínek a lze se zabránit kolapsu hydrofobní fáze. Tyto modifikované sloupce C18 se nazývají vodné sloupce C18, jmenovitě sloupce C18AQ, které jsou navrženy pro vysoce vodné eluční podmínky a mohou tolerovat 100% vodný systém. Sloupce C18AQ byly široce aplikovány při separaci a čištění silných polárních sloučenin, včetně organických kyselin, peptidů, nukleosidů a vitamínů rozpustných ve vodě.
Odsolování je jednou z typických aplikací sloupců C18AQ ve čištění blesku pro vzorky, které odstraní složky soli nebo pufru v rozpouštědle vzorku, aby se usnadnilo použití vzorku v následujících studiích. V tomto příspěvku byl jako vzorek použit brilantní modrý FCF se silnou polaritou a čištěn na sloupci C18AQ. Rozpouštědlo vzorku bylo nahrazeno organickým rozpouštědlem z pufrového roztoku, čímž usnadnilo následující rotační odpařování, jakož i úspora rozpouštědel a provozního času. Kromě toho byla čistota vzorku vylepšena odstraněním některých nečistot ve vzorku.
Experimentální část
Obrázek 2. Chemická struktura vzorku.
Jako vzorek v tomto příspěvku byl použit skvělý modrý FCF. Čistota surového vzorku byla 86% a chemická struktura vzorku byla znázorněna na obrázku 2. Pro přípravu roztoku vzorku, 300 mg práškové surové pevné látky z brilantní modré FCF bylo rozpuštěno v 1 M nah2po4 pufrovém roztoku a otřásl se dobře, aby se stal zcela jasným roztokem. Roztok vzorku byl poté injikován do sloupce blesku injektorem. Experimentální nastavení čištění blesku je uvedeno v tabulce 1.
| Nástroj | Stroj sepabean ™2 | |||
| Kazety | 12 g sepaflash c18 rp flash kazeta (sférická oxid křemičitý, 20-45 μm, 100 Á, číslo objednávky: SW-5222-012-SP) | 12 g sepaflash C18aq RP Flash Cartridge (sférický oxid křemičitý, 20-45 μm, 100 Á, číslo objednávky ： SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Vlnová délka | 254 nm | |||
| Mobilní fáze | Rozpouštědlo a ： Voda Rozpouštědlo B ： Methanol | |||
| Průtok | 30 ml/min | |||
| Načítání vzorku | 300 mg (brilantní modrá FCF s čistotou 86%) | |||
| Gradient | Čas (CV) | Rozpouštědlo B (%) | Čas (CV) | Rozpouštědlo B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Výsledky a diskuse
Pro flash kazety sepaflash C18AQ RP byla použita pro odsolování a čištění vzorků. Byl použit krokový gradient, ve kterém byla čistá voda použita jako mobilní fáze na začátku eluce a spuštěna pro 10 objemů sloupců (CV). Jak je znázorněno na obrázku 3, při použití čisté vody jako mobilní fáze byl vzorek zcela zadržen na bleskové kazetě. Dále byl methanol v mobilní fázi přímo zvýšen na 100% a gradient byl udržován na 7,5 CV. Vzorek byl eluován od 11,5 do 13,5 cv. Ve shromážděných frakcích byl roztok vzorku nahrazen roztokem pufru Nah2PO4 na methanol. Ve srovnání s vysoce vodným roztokem byl methanol mnohem snazší odstranit otočným odpařováním v následujícím kroku, který usnadňuje následující výzkum.
Obrázek 3. Flash chromatogram vzorku na kazetě C18AQ.
Pro porovnání retenčního chování kazety C18AQ a pravidelné kazety C18 pro vzorky silné polarity byl proveden paralelní srovnávací test. Byla použita blesková kazeta sepaflash C18 RP a flash chromatogram pro vzorek byl prokázán na obrázku 4. Pro běžné kazety C18 je nejvyšší tolerovaný poměr vodné fáze asi 90%. Proto byl počáteční gradient nastaven na 10% methanolu v 90% vody. Jak je znázorněno na obrázku 4, v důsledku hydrofobní fázové kolaps řetězců C18 způsobených vysokým vodným poměrem byl vzorek stěží zachován na běžné kazetě C18 a byl přímo eluován mobilní fází. Výsledkem je, že provoz odsolování nebo čištění vzorku nelze dokončit.
Obrázek 4. Flash chromatogram vzorku na běžné kazetě C18.
Ve srovnání s lineárním gradientem má použití krokového gradientu následující výhody:
1. Použití rozpouštědla a doba běhu pro čištění vzorku se zkrátí.
2. Cílový produkt eluje v ostrém vrcholu, který snižuje objem shromážděných frakcí, a tak usnadňuje následující rotační odpařování a úsporu času.
3.. Shromážděný produkt je v methanolu, který se snadno odpaří, a proto se zkrátí doba sušení.
Závěrem lze říci, že pro čištění vzorku, který je silně polární nebo vysoce hydrofilní, SEPAFLASH C18AQ RP Flash Cartridges kombinující se s přípravným flash chromatografickým systémem Sepabean ™ by mohl nabídnout rychlé a efektivní řešení.
O Flash kazetách série C18 RP Flash Cathridges série C18 RP
Existuje řada sepaflash c18aq RP flash kazet s různými specifikacemi z technologie Santai (jak je uvedeno v tabulce 2).
| Číslo položky | Velikost sloupce | Průtok (ML/min) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabulka 2. Sepaflash C18aq RP Flash Cartridges.
Balicí materiály: Vysoce účinná sférická sférická C18 (AQ) oxid křemičitý, 20-45 μm, 100 Á.
Logy (jak je uvedeno v tabulce 2).
Čas příspěvku: 27. srpna-2018