Hongcheng Wang, Bo Xu
Centru R&D di l'applicazione
Introduzione
Sicondu a polarità relative di a fase stazionaria è a fase mobile, a cromatografia liquida pò esse divisa in cromatografia in fase normale (NPC) è cromatografia in fase inversa (RPC).Per RPC, a polarità di a fase mobile hè più forte di quella di a fase stazionaria.RPC hè diventatu u più utilizatu in i modi di separazione di cromatografia liquida per via di a so alta efficienza, bona risuluzione è mecanismu di ritenzione chjaru.Dunque RPC hè adattatu per a separazione è a purificazione di diversi composti polari o non polari, cumprese alcaloids, carbuidrati, acidi grassi, steroidi, acidi nucleici, aminoacidi, peptidi, proteini, etc. a matrice di gel di silice chì hè ligata cù diversi gruppi funziunali, cumpresi C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, etc. Frà questi gruppi funziunali bonded, u più utilizatu hè C18.Hè stimatu chì più di 80% di RPC sò avà aduprendu a fase ligata C18.Dunque a colonna di cromatografia C18 hè diventata una colonna universale indispensabile per ogni laboratoriu.
Ancu se a colonna C18 pò esse usata in una larga gamma di applicazioni, però, per alcuni campioni chì sò assai polari o altamente idrofili, e culonne C18 regulari ponu avè prublemi quandu sò aduprate per purificà tali campioni.In RPC, i solventi di l'eluzione cumunimenti usati ponu esse urdinati secondu a so polarità: acqua < metanol < acetonitrile < etanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Per assicurà una bona ritenzione nantu à a colonna per questi campioni (forti polari o altamente idrofili), una alta proporzione di sistema acquoso hè necessariu per esse usata cum'è a fase mobile.Tuttavia, quandu si usa un sistema d'acqua pura (cumpresa l'acqua pura o una soluzione di sali puri) cum'è a fase mobile, a longa catena di carbone nantu à a fase stazionaria di a colonna C18 tende à evità l'acqua è mischjà l'una cù l'altri, risultannu in una diminuzione istantanea di l'acqua. capacità di retenzioni di a colonna o ancu senza ritenzione.Stu fenomenu hè chjamatu "collassu di fase idrofoba" (cum'è mostra in a parte sinistra di a Figura 1).Ancu s'è sta situazione hè reversibile quandu a colonna hè lavata cù solventi organici cum'è metanol o acetonitrile, pò ancu causà danni à a colonna.Dunque, hè necessariu di prevene sta situazione.
Figura 1. U schema schematicu di e fasi ligate nantu à a superficia di gel di silice in a colonna C18 regulare (left) è a colonna C18AQ (right).
Per affruntà i prublemi sopra citati, i fabricatori di materiali di imballaggio cromatografici anu fattu migliurà tecniche.Unu di sti migliuramentu hè di fà alcune mudificazioni nantu à a superficia di a matrice di silice, cum'è l'intruduzioni di gruppi cianichi idrofili (cum'è mostra in a parte dritta di a Figura 1), per fà a superficia di u gel di silice più idrofila.Cusì, e catene C18 nantu à a superficia di a silice puderanu esse allargate cumplettamente in cundizioni altamente acquose è u colapsu di a fase idrofoba puderia esse evitata.Sti culonni C18 mudificate sò chjamati culonni C18 aqueous, vale à dì colonne C18AQ, chì sò pensati per e cundizioni d'eluzione altamente aquosa è ponu tollerà un sistema 100% aqueous.I culonni C18AQ sò stati largamente appiicati in a separazione è a purificazione di composti polari forti, cumpresi l'acidi organici, i peptidi, i nucleosidi è i vitamini solubili in acqua.
A desalatura hè una di l'applicazioni tipiche di e colonne C18AQ in a purificazione flash per i campioni, chì sguassate i cumpunenti di u salinu o buffer in u solvente di mostra per facilità l'applicazione di a mostra in studii successivi.In questu post, u Brilliant Blue FCF cù una forte polarità hè stata utilizata cum'è mostra è purificata nantu à a colonna C18AQ.U solvente di mostra hè statu rimpiazzatu da u solvente organicu da a soluzione tampone, facilitendu cusì a seguente evaporazione rotativa è risparmià solventi è tempu di operazione.Inoltre, a purezza di a mostra hè stata migliurata rimuovendu alcune impurità in a mostra.
Sezione Sperimentale
Figura 2. A struttura chimica di a mostra.
U Brilliant Blue FCF hè stata utilizata cum'è mostra in questu post.A purità di a mostra cruda era 86% è a struttura chimica di a mostra hè stata mostrata in a Figura 2. Per preparà a suluzione di mostra, 300 mg di solidu crudu pulverulente di Brilliant Blue FCF hè stata dissolta in una soluzione di tampone 1 M NaH2PO4 è si scuzzulò bè per diventà. una suluzione cumplettamente chjaru.A suluzione di mostra hè stata poi injectata in a colonna flash da un injector.A configurazione sperimentale di a purificazione flash hè listata in a Tabella 1.
| Strumentu | Macchina SepaBean™2 | |||
| Cartuccia | Cartuccia flash SepaFlash C18 RP da 12 g (silice sferica, 20 - 45 μm, 100 Å, Numero d'ordine: SW-5222-012-SP) | Cartuccia flash SepaFlash C18AQ RP da 12 g (silice sferica, 20 - 45 μm, 100 Å, Numero d'ordine: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Lunghezza d'onda | 254 nm | |||
| Fase mobile | Solvente A: acqua Solvente B: metanolu | |||
| Rate di flussu | 30 ml/min | |||
| Carica di mostra | 300 mg (Brillant Blue FCF cù a purezza di 86%) | |||
| Gradient | Tempu (CV) | Solvente B (%) | Tempu (CV) | Solvente B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Risultati è discussione
Una cartuccia flash SepaFlash C18AQ RP hè stata utilizata per a desalatura è a purificazione di campioni.U gradiente di u passu hè stata utilizata in quale l'acqua pura hè stata aduprata cum'è a fase mobile à l'iniziu di l'eluzione è eseguite per 10 volumi di colonna (CV).Cum'è mostra in a Figura 3, quandu si usa l'acqua pura cum'è a fase mobile, a mostra hè stata ritenuta cumplettamente nantu à u cartucciu flash.In seguitu, u metanolu in a fase mobile hè stata direttamente aumentata à 100% è u gradiente hè stata mantinuta per 7,5 CV.A mostra hè stata eluita da 11,5 à 13,5 CV.In e fraccioni cullate, a suluzione di mostra hè stata rimpiazzata da a suluzione di tampon NaH2PO4 à metanolu.In cunfrontu cù a suluzione altamente aquosa, u metanolu era assai più faciule per esse eliminatu da l'evaporazione rotativa in u passu sussegwente, chì facilita a ricerca dopu.
Figura 3. U cromatogramma flash di a mostra nantu à una cartuccia C18AQ.
Per paragunà u cumpurtamentu di ritenzione di a cartuccia C18AQ è a cartuccia C18 regulare per campioni di forte polarità, hè stata realizata una prova di paragone parallela.Un cartuccia flash SepaFlash C18 RP hè stata utilizata è u cromatogramma flash per a mostra hè stata mostrata in a Figura 4. Per i cartucce C18 regularmente, u più altu rapportu di fase aquosa tolerata hè di circa 90%.Dunque, u gradiente di partenza hè statu stabilitu à 10% metanol in 90% acqua.Cum'è mostra in a Figura 4, per via di u colapsu di a fase idrofoba di e catene C18 causatu da un altu rapportu acquoso, a mostra hè stata appena ritenuta nantu à a cartuccia C18 regulare è hè stata direttamente eluita da a fase mobile.In u risultatu, l'operazione di desalatura o purificazione di mostra ùn pò micca esse cumpletata.
Figura 4. U cromatogramma flash di a mostra nantu à un cartucciu C18 regular.
In cunfrontu cù u gradiente lineare, l'usu di gradiente di gradiente hà i seguenti vantaghji:
1. L'usu di solventi è u tempu di esecuzione per a purificazione di mostra hè ridutta.
2. U pruduttu di destinazione elutes in un piccu sharp, chì reduces u vulume di fraccioni culligati è cusì facilite a seguente evaporazione rotary oltri a salvà tempu.
3. U pruduttu cullucatu hè in metanolu chì hè faciule d'evaporà, cusì u tempu di siccà hè ridutta.
In cunclusione, per a purificazione di u campione chì hè fortemente polare o altamente idrofilo, cartucce flash SepaFlash C18AQ RP combinate cù u sistema di cromatografia flash preparativa SepaBean™ Machine puderia offre una soluzione rapida è efficiente.
À propositu di i cartucce flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Ci hè una serie di cartucce flash SepaFlash C18AQ RP cù diverse specificazioni da Santai Technology (cum'è mostra in a Tabella 2).
| Numeru di l'articulu | Dimensione di a colonna | Rate di flussu (ml/min) | Pressione max (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Table 2. Cartuccia flash SepaFlash C18AQ RP.
Materiali di imballaggio: silice sferica ad alta efficienza C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
(cum'è mostra in a Tabella 2).
Tempu di post: Aug-27-2018