Hongcheng Wang, Bo Xu
Application R&D Center
Pasiuna
Sumala sa mga relatibong polaridad sa stasionary phase ug mobile phase, ang liquid chromatography mahimong bahinon sa normal nga phase chromatography (NPC) ug reversed phase chromatography (RPC).Para sa RPC, ang polarity sa mobile phase mas lig-on kaysa sa stationary phase.Ang RPC nahimong labing kaylap nga gigamit sa liquid chromatography separation modes tungod sa taas nga efficiency, maayo nga resolusyon ug klaro nga retention mechanism.Busa RPC mao ang angay alang sa pagbulag ug pagputli sa nagkalain-laing polar o non-polar compounds, lakip na ang alkaloids, carbohydrates, tambok mga asido, steroid, nucleic acid, amino acids, peptides, protina, ug uban pa. ang silica gel matrix nga gigapos sa lain-laing mga functional nga mga grupo, lakip na ang C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, ug uban pa.Gibanabana nga labaw pa sa 80% sa RPC ang karon naggamit sa C18 bonded phase.Busa ang kolum sa chromatography sa C18 nahimong kinahanglan nga adunay unibersal nga kolum sa matag laboratoryo.
Bisan kung ang C18 nga kolum mahimong magamit sa usa ka halapad kaayo nga mga aplikasyon, bisan pa, alang sa pipila nga mga sample nga polar kaayo o kaayo hydrophilic, ang mga regular nga kolum nga C18 mahimong adunay mga problema kung gigamit sa pagputli sa ingon nga mga sample.Sa RPC, ang kasagarang gigamit nga elution solvents mahimong orderon sumala sa ilang polarity: tubig < methanol < acetonitrile < ethanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Aron masiguro ang maayo nga pagpabilin sa kolum alang niini nga mga sampol (lig-on nga polar o taas nga hydrophilic), kinahanglan ang taas nga proporsyon sa aqueous system aron magamit isip mobile phase.Bisan pa, kung gigamit ang lunsay nga sistema sa tubig (lakip ang lunsay nga tubig o lunsay nga solusyon sa asin) ingon nga mobile phase, ang taas nga kadena sa carbon sa naghunong nga hugna sa kolum sa C18 lagmit nga maglikay sa tubig ug magsagol sa usag usa, nga moresulta sa usa ka dali nga pagkunhod sa retensyon kapasidad sa kolum o bisan walay retensyon.Kini nga panghitabo gitawag nga "hydrophobic phase collapse" (sama sa gipakita sa wala nga bahin sa Figure 1).Bisan kung kini nga kahimtang mabalik kung ang kolum gihugasan gamit ang mga organikong solvent sama sa methanol o acetonitrile, mahimo gihapon kini hinungdan sa kadaot sa kolum.Busa, kinahanglan nga mapugngan kini nga sitwasyon nga mahitabo.
Figure 1. Ang schematic diagram sa mga bonded phase sa ibabaw sa silica gel sa regular nga C18 column (wala) ug C18AQ column (tuo).
Aron matubag ang mga problema nga gihisgutan sa ibabaw, ang mga tiggama sa mga materyales sa pagputos sa chromatographic naghimo og mga pag-uswag sa teknikal.Usa niini nga mga kalamboan mao ang paghimo sa pipila ka mga kausaban sa ibabaw sa silica matrix, sama sa pagpaila sa hydrophilic cyano nga mga grupo (sama sa gipakita sa tuo nga bahin sa Figure 1), sa paghimo sa nawong sa silica gel nga mas hydrophilic.Sa ingon ang mga kadena sa C18 sa ibabaw sa silica mahimong hingpit nga mapalawig sa ilawom sa mga kondisyon nga adunay tubig ug malikayan ang pagkahugno sa hydrophobic phase.Kini nga mga giusab nga C18 nga mga kolum gitawag nga adunay tubig nga C18 nga mga kolum, nga mao ang C18AQ nga mga kolum, nga gidisenyo alang sa labi ka tubigon nga mga kondisyon sa elution ug makaagwanta sa 100% nga aqueous system.Ang mga kolum sa C18AQ kaylap nga gigamit sa pagbulag ug pagputli sa kusgan nga mga polar compound, lakip ang mga organikong asido, peptide, nucleosides ug mga bitamina nga matunaw sa tubig.
Ang desalting maoy usa sa kasagarang aplikasyon sa mga kolum sa C18AQ sa flash purification para sa mga sample, nga magtangtang sa asin o buffer components sa sample solvent aron mapadali ang paggamit sa sample sa sunod nga mga pagtuon.Sa kini nga post, ang Brilliant Blue FCF nga adunay kusog nga polarity gigamit ingon sample ug giputli sa kolum sa C18AQ.Ang sample solvent gipulihan sa organikong solvent gikan sa buffer solution, sa ingon nagpasayon sa mosunod nga rotary evaporation ingon man usab sa pagluwas sa mga solvent ug oras sa pag-operate.Dugang pa, ang kaputli sa sample gipauswag pinaagi sa pagtangtang sa pipila ka mga hugaw sa sample.
Eksperimental nga Seksyon
Figure 2. Ang kemikal nga istruktura sa sample.
Ang Brilliant Blue FCF gigamit isip sample niini nga post.Ang kaputli sa hilaw nga sample mao ang 86% ug ang kemikal nga istruktura sa sample gipakita sa Figure 2. Aron sa pag-andam sa sample nga solusyon, 300 mg powdery crude solid sa Brilliant Blue FCF ang natunaw sa 1 M NaH2PO4 buffer solution ug giuyog pag-ayo aron mahimong hingpit nga tin-aw nga solusyon.Ang sample nga solusyon dayon gi-inject sa flash column pinaagi sa usa ka injector.Ang eksperimento nga setup sa flash purification gilista sa Table 1.
| Instrumento | SepaBean™ nga Makina2 | |||
| Mga cartridge | 12 g SepaFlash C18 RP flash cartridge (spherical silica, 20 - 45 μm, 100 Å, Order number: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash cartridge (spherical silica, 20 - 45 μm, 100 Å, Order number：SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| wavelength | 254 nm | |||
| Mobile nga hugna | Solvent A: Tubig Solvent B: Methanol | |||
| Laygay sa agos | 30 mL/min | |||
| Sample loading | 300 mg (Brilliant Blue FCF nga adunay kaputli nga 86%) | |||
| Gradient | Oras (CV) | Solvent B (%) | Oras (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Mga Resulta ug Panaghisgot
Usa ka SepaFlash C18AQ RP flash cartridge gigamit alang sa sample desalting ug purification.Gigamit ang gradient sa lakang diin gigamit ang puro nga tubig isip mobile phase sa pagsugod sa elution ug gipadagan sa 10 column volumes (CV).Sama sa gipakita sa Figure 3, kung gigamit ang lunsay nga tubig ingon nga mobile phase, ang sample hingpit nga gipabilin sa flash cartridge.Sunod, ang methanol sa mobile phase direkta nga nadugangan sa 100% ug ang gradient gipadayon alang sa 7.5 CV.Ang sample gikuha gikan sa 11.5 hangtod 13.5 CV.Sa nakolekta nga mga fraction, ang sample nga solusyon giilisan gikan sa NaH2PO4 buffer solution ngadto sa methanol.Kung itandi sa taas nga tubig nga solusyon, ang methanol mas dali nga makuha pinaagi sa rotary evaporation sa sunod nga lakang, nga nagpadali sa mosunod nga panukiduki.
Figure 3. Ang flash chromatogram sa sample sa usa ka C18AQ cartridge.
Aron itandi ang pagpabilin nga kinaiya sa C18AQ cartridge ug regular nga C18 cartridge alang sa mga sample nga lig-on nga polarity, gihimo ang parallel comparison test.Usa ka SepaFlash C18 RP flash cartridge ang gigamit ug ang flash chromatogram alang sa sample gipakita sa Figure 4. Alang sa regular nga C18 cartridges, ang pinakataas nga tolerated aqueous phase ratio maoy mga 90%.Busa ang pagsugod nga gradient gibutang sa 10% methanol sa 90% nga tubig.Sama sa gipakita sa Figure 4, tungod sa pagkahugno sa hydrophobic phase sa mga kadena sa C18 tungod sa taas nga ratio sa tubig, ang sample halos wala gitipig sa regular nga cartridge sa C18 ug direkta nga gipagawas sa mobile phase.Ingon nga resulta, ang operasyon sa sample desalting o purification dili makompleto.
Figure 4. Ang flash chromatogram sa sample sa usa ka regular nga C18 cartridge.
Kung itandi sa linear gradient, ang paggamit sa step gradient adunay mga mosunud nga bentaha:
1. Ang paggamit sa solvent ug ang oras sa pagdagan alang sa pagputli sa sample gipakunhod.
2. Ang target nga produkto elutes sa usa ka mahait nga peak, nga pagkunhod sa gidaghanon sa mga nakolekta fractions ug sa ingon mapadali ang mosunod nga rotary evaporation ingon man sa pagluwas sa panahon.
3. Ang nakolekta nga produkto naa sa methanol nga dali nga maalisngaw, busa ang oras sa pagpauga maminusan.
Sa konklusyon, alang sa pagputli sa sample nga kusgan nga polar o high hydrophilic, ang SepaFlash C18AQ RP flash cartridges nga naghiusa sa preparative flash chromatography system nga SepaBean ™ Machine mahimong maghatag usa ka paspas ug episyente nga solusyon.
Mahitungod sa SepaFlash Bonded Series C18 RP flash cartridges
Adunay usa ka serye sa SepaFlash C18AQ RP flash cartridges nga adunay lain-laing mga detalye gikan sa Santai Technology (sama sa gipakita sa Table 2).
| Numero sa butang | Gidak-on sa Kolum | Rate sa Pag-agos (mL/min) | Max.Presyur (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Talaan 2. SepaFlash C18AQ RP flash cartridges.
Mga materyales sa pagputos: High-efficiency spherical C18(AQ)-bonded silica, 20 - 45 μm, 100 Å.
logy (sama sa gipakita sa Table 2).
Oras sa pag-post: Aug-27-2018