Rui Huang, Bo Xu
Centre d'R+D d'aplicacions
Introducció
Un pèptid és un compost compost d'aminoàcids, cadascun dels quals té propietats físiques i químiques úniques a causa dels diferents tipus i ordre dels residus d'aminoàcids que constitueixen la seva seqüència.Amb el desenvolupament de la síntesi química en fase sòlida, la síntesi química de diversos pèptids actius ha avançat molt.Tanmateix, a causa de la complicada composició del pèptid obtingut per síntesi en fase sòlida, el producte final s'ha de purificar mitjançant mètodes de separació fiables.Els mètodes de purificació comunament utilitzats per a pèptids inclouen la cromatografia d'intercanvi iònic (IEC) i la cromatografia líquida d'alt rendiment en fase inversa (RP-HPLC), que tenen els inconvenients d'una baixa capacitat de càrrega de mostres, un alt cost dels mitjans de separació, equips de separació complicats i costosos, etc. Per a la purificació ràpida de pèptids de molècules petites (PM < 1 kDa), Santai Technologies va publicar prèviament un cas d'aplicació reeixit, en el qual es va utilitzar un cartutx SepaFlash RP C18 per a la purificació ràpida de timopentina (TP-5) i el s'ha obtingut el producte objectiu que compleix els requisits.
Figura 1. 20 aminoàcids comuns (reproduïts a partir de www.bachem.com).
Hi ha 20 tipus d'aminoàcids comuns en la composició dels pèptids.Aquests aminoàcids es poden dividir en els següents grups segons la seva polaritat i propietat àcid-base: no polars (hidrofòbics), polars (sense càrrega), àcids o bàsics (com es mostra a la figura 1).En una seqüència de pèptids, si els aminoàcids que constitueixen la seqüència són majoritàriament polars (tal com es marca amb color rosa a la figura 1), com ara cisteïna, glutamina, asparagina, serina, treonina, tirosina, etc., aquest pèptid podria tenir un fort polaritat i ser altament solubles en aigua.Durant el procediment de purificació d'aquestes mostres de pèptids polars forts mitjançant cromatografia en fase inversa, es produirà un fenomen anomenat col·lapse de fase hidrofòbica (consulteu una nota d'aplicació publicada anteriorment per Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).En comparació amb les columnes C18 normals, les columnes C18AQ millorades són les més adequades per a la purificació de mostres polars o hidròfiles fortes.En aquesta publicació, es va utilitzar un pèptid polar fort com a mostra i es va purificar mitjançant una columna C18AQ.Com a resultat, es va obtenir el producte objectiu que compleix els requisits i es podria utilitzar en la recerca i desenvolupament següent.
| Instrument | SepaBean™màquina 2 | |||
| Cartutxos | Cartutx de flaix SepaFlash C18 RP de 12 g (sílice esfèrica, 20 - 45 μm, 100 Å, número de comanda: SW-5222-012-SP) | Cartutx de flaix SepaFlash C18AQ RP de 12 g (sílice esfèrica, 20 - 45 μm, 100 Å, número de comanda: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Longitud d'ona | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Fase mòbil | Dissolvent A: Aigua Dissolvent B: Acetonitril | |||
| Velocitat de flux | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Càrrega de mostres | 30 mg | |||
| Gradient | Hora (CV) | dissolvent B (%) | Temps (min) | dissolvent B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Resultats i discussió
Per comparar el rendiment de purificació de la mostra de pèptids polars entre la columna C18 normal i la columna C18AQ, vam utilitzar una columna C18 normal per a la purificació flash de la mostra com a principi.Com es mostra a la figura 2, a causa del col·lapse de la fase hidrofòbica de les cadenes C18 causat per una elevada proporció aquosa, la mostra amb prou feines es va retenir al cartutx C18 normal i es va eluir directament per la fase mòbil.Com a resultat, la mostra no es va separar i purificar eficaçment.
Figura 2. El cromatograma flash de la mostra en un cartutx C18 normal.
A continuació, vam utilitzar una columna C18AQ per a la purificació flash de la mostra.Com es mostra a la figura 3, el pèptid es va retenir eficaçment a la columna i després es va eluir.El producte objectiu es va separar de les impureses de la mostra en brut i es va recollir.Després de la liofilització i després analitzat per HPLC, el producte purificat té una puresa del 98,2% i es podria utilitzar encara més per a la investigació i desenvolupament del següent pas.
Figura 3. El cromatograma flash de la mostra en un cartutx C18AQ.
En conclusió, el cartutx flash SepaFlash C18AQ RP combinat amb el sistema de cromatografia flash SepaBean™La màquina podria oferir una solució ràpida i eficaç per a la purificació de mostres polars o hidròfiles fortes.
Hi ha una sèrie de cartutxos de flaix SepaFlash C18AQ RP amb diferents especificacions de Santai Technology (com es mostra a la taula 2).
| Número d'article | Mida de la columna | Velocitat de flux (ml/min) | Pressió màxima (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Taula 2. Cartutxos flash SepaFlash C18AQ RP.Materials d'embalatge: sílice unida amb C18(AQ) esfèrica d'alta eficiència, 20 - 45 μm, 100 Å.
Per obtenir més informació sobre les especificacions detallades de la màquina SepaBean™ o la informació de comandes dels cartutxos flash de la sèrie SepaFlash, visiteu el nostre lloc web.
Hora de publicació: 12-octubre-2018