Hongcheng Wang, Bo Xu
Centre d'R+D d'aplicacions
Introducció
Segons les polaritats relatives de la fase estacionària i la fase mòbil, la cromatografia líquida es pot dividir en cromatografia en fase normal (NPC) i cromatografia en fase inversa (RPC).Per a RPC, la polaritat de la fase mòbil és més forta que la de la fase estacionària.RPC s'ha convertit en el més utilitzat en els modes de separació per cromatografia líquida a causa de la seva alta eficiència, bona resolució i mecanisme de retenció clar.Per tant, RPC és adequat per a la separació i purificació de diversos compostos polars o no polars, inclosos alcaloides, hidrats de carboni, àcids grassos, esteroides, àcids nucleics, aminoàcids, pèptids, proteïnes, etc. En RPC, la fase estacionària més utilitzada és la matriu de gel de sílice que s'uneix amb diversos grups funcionals, incloent C18, C8, C4, fenil, ciano, amino, etc. Entre aquests grups funcionals units, el més utilitzat és el C18.S'estima que més del 80% dels RPC utilitzen ara la fase d'enllaç C18.Per tant, la columna de cromatografia C18 s'ha convertit en una columna universal imprescindible per a tots els laboratoris.
Tot i que la columna C18 es pot utilitzar en una àmplia gamma d'aplicacions, però, per a algunes mostres que són molt polars o altament hidròfiles, les columnes C18 normals poden tenir problemes quan s'utilitzen per purificar aquestes mostres.En RPC, els dissolvents d'elució utilitzats habitualment es poden ordenar segons la seva polaritat: aigua < metanol < acetonitril < etanol < tetrahidrofuran < isopropanol.Per assegurar una bona retenció a la columna d'aquestes mostres (polars forts o altament hidròfiles), cal utilitzar una proporció elevada de sistema aquós com a fase mòbil.Tanmateix, quan s'utilitza un sistema d'aigua pura (inclosa aigua pura o solució de sal pura) com a fase mòbil, la llarga cadena de carboni de la fase estacionària de la columna C18 tendeix a evitar l'aigua i barrejar-se entre si, donant lloc a una disminució instantània de la capacitat de retenció de la columna o fins i tot cap retenció.Aquest fenomen s'anomena "col·lapse de fase hidrofòbica" (com es mostra a la part esquerra de la figura 1).Tot i que aquesta situació és reversible quan la columna es renta amb dissolvents orgànics com metanol o acetonitril, encara pot causar danys a la columna.Per tant, cal evitar que es produeixi aquesta situació.
Figura 1. El diagrama esquemàtic de les fases unides a la superfície del gel de sílice a la columna normal C18 (esquerra) i la columna C18AQ (dreta).
Per solucionar els problemes esmentats anteriorment, els fabricants de materials d'embalatge cromatogràfics han fet millores tècniques.Una d'aquestes millores és fer algunes modificacions a la superfície de la matriu de sílice, com la introducció de grups ciano hidròfils (com es mostra a la part dreta de la figura 1), per fer que la superfície del gel de sílice sigui més hidròfila.Així, les cadenes C18 a la superfície de la sílice es podrien estendre completament en condicions altament aquoses i es podria evitar el col·lapse de la fase hidròfoba.Aquestes columnes C18 modificades s'anomenen columnes C18 aquoses, és a dir, columnes C18AQ, que estan dissenyades per a condicions d'elució molt aquoses i poden tolerar un sistema aquós al 100%.Les columnes C18AQ s'han aplicat àmpliament en la separació i purificació de compostos polars forts, inclosos àcids orgànics, pèptids, nucleòsids i vitamines solubles en aigua.
La dessalació és una de les aplicacions típiques de les columnes C18AQ en la purificació flash de mostres, que elimina la sal o els components del tampó del dissolvent de la mostra per facilitar l'aplicació de la mostra en estudis posteriors.En aquesta publicació, es va utilitzar el Brilliant Blue FCF amb una polaritat forta com a mostra i es va purificar a la columna C18AQ.El dissolvent de la mostra es va substituir per un dissolvent orgànic de la solució tampó, facilitant així la següent evaporació rotativa i estalviant dissolvents i temps de funcionament.A més, es va millorar la puresa de la mostra eliminant algunes impureses de la mostra.
Secció Experimental
Figura 2. L'estructura química de la mostra.
El Brilliant Blue FCF es va utilitzar com a mostra en aquesta publicació.La puresa de la mostra en brut era del 86% i l'estructura química de la mostra es mostrava a la figura 2. Per preparar la solució de la mostra, es van dissoldre 300 mg de sòlid brut en pols de Brilliant Blue FCF en una solució tampó de NaH2PO4 1 M i es va sacsejar bé per convertir-se en una solució completament clara.A continuació, la solució de mostra es va injectar a la columna de flaix mitjançant un injector.La configuració experimental de la purificació de flaix es mostra a la taula 1.
| Instrument | Màquina SepaBean™2 | |||
| Cartutxos | Cartutx de flaix SepaFlash C18 RP de 12 g (sílice esfèrica, 20 - 45 μm, 100 Å, número de comanda: SW-5222-012-SP) | Cartutx de flaix SepaFlash C18AQ RP de 12 g (sílice esfèrica, 20 - 45 μm, 100 Å, número de comanda: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Longitud d'ona | 254 nm | |||
| Fase mòbil | Solvent A: Aigua Solvent B: metanol | |||
| Velocitat de flux | 30 ml/min | |||
| Càrrega de mostres | 300 mg (Blue brillant FCF amb la puresa del 86%) | |||
| Gradient | Hora (CV) | dissolvent B (%) | Hora (CV) | dissolvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultats i discussió
Es va utilitzar un cartutx flash SepaFlash C18AQ RP per a la dessalació i purificació de mostres.Es va utilitzar un gradient de pas en què es va utilitzar aigua pura com a fase mòbil a l'inici de l'elució i es va executar durant 10 volums de columna (CV).Com es mostra a la figura 3, quan s'utilitza aigua pura com a fase mòbil, la mostra es va retenir completament al cartutx flash.A continuació, el metanol en la fase mòbil es va augmentar directament al 100% i es va mantenir el gradient durant 7,5 CV.La mostra es va eluir d'11,5 a 13,5 CV.A les fraccions recollides, la solució de mostra es va substituir de la solució tampó de NaH2PO4 per metanol.En comparació amb una solució altament aquosa, el metanol era molt més fàcil d'eliminar per evaporació rotativa en el pas posterior, cosa que facilita la recerca següent.
Figura 3. El cromatograma flash de la mostra en un cartutx C18AQ.
Per comparar el comportament de retenció del cartutx C18AQ i el cartutx C18 normal per a mostres de polaritat forta, es va realitzar una prova de comparació paral·lela.Es va utilitzar un cartutx de flaix SepaFlash C18 RP i el cromatograma de flaix de la mostra es va mostrar a la figura 4. Per als cartutxos C18 normals, la proporció de fase aquosa més alta tolerada és d'aproximadament el 90%.Per tant, el gradient inicial es va establir al 10% de metanol en un 90% d'aigua.Com es mostra a la figura 4, a causa del col·lapse de la fase hidròfoba de les cadenes C18 causat per una elevada proporció aquosa, la mostra amb prou feines es va retenir al cartutx C18 normal i es va eluir directament per la fase mòbil.Com a resultat, l'operació de dessalació o purificació de mostres no es pot completar.
Figura 4. El cromatograma flash de la mostra en un cartutx C18 normal.
En comparació amb el gradient lineal, l'ús del gradient de pas té els avantatges següents:
1. Es redueix l'ús de dissolvents i el temps d'execució per a la purificació de mostres.
2. El producte objectiu elueix en un pic agut, la qual cosa redueix el volum de les fraccions recollides i, per tant, facilita la següent evaporació rotativa i estalvia temps.
3. El producte recollit es troba en metanol que és fàcil d'evaporar, així es redueix el temps d'assecat.
En conclusió, per a la purificació de la mostra que és fortament polar o altament hidròfila, els cartutxos flash SepaFlash C18AQ RP que es combinen amb el sistema de cromatografia flash preparativa SepaBean™ Machine podrien oferir una solució ràpida i eficient.
Sobre els cartutxos flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Hi ha una sèrie de cartutxos de flaix SepaFlash C18AQ RP amb diferents especificacions de Santai Technology (com es mostra a la taula 2).
| Número d'article | Mida de la columna | Velocitat de flux (ml/min) | Pressió màxima (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Taula 2. Cartutxos flash SepaFlash C18AQ RP.
Materials d'embalatge: sílice unida amb C18(AQ) esfèrica d'alta eficiència, 20 - 45 μm, 100 Å.
lògica (com es mostra a la taula 2).
Hora de publicació: 27-agost-2018