Hongcheng Wang, bo xu
Centre de R + D de l'aplicació
Presentació
Segons les polaritats relatives de la fase estacionària i la fase mòbil, la cromatografia líquida es pot dividir en cromatografia en fase normal (NPC) i cromatografia en fase invertida (RPC). Per a RPC, la polaritat de la fase mòbil és més forta que la de la fase estacionària. El RPC s’ha convertit en el més utilitzat en els modes de separació de cromatografia líquida a causa de la seva alta eficiència, bona resolució i un mecanisme clar de retenció. Per tant, el RPC és adequat per a la separació i purificació de diversos compostos polars o no polars, inclosos alcaloides, hidrats de carboni, àcids grassos, esteroides, àcids nucleics, aminoàcids, pèptids, proteïnes, en RPC, la fase estacionària més utilitzada és la matriu de gel de sílice que s’uneix amb diversos grups funcionals, inclosos C18, c8, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c4, c8, c4, c8, c4, c8, c4, c8, c8, c8, c8, c8, c8, c8, c8, c8, c8 Cyano, amino, etc. Entre aquests grups funcionals units, el més utilitzat és C18. Es calcula que més del 80% de RPC ara utilitzen fase unida C18. Per tant, la columna de cromatografia C18 s'ha convertit en una columna universal imprescindible per a cada laboratori.
Tot i que la columna C18 es pot utilitzar en una àmplia gamma d'aplicacions, però, per a algunes mostres molt polars o altament hidrofíliques, les columnes C18 regulars poden tenir problemes quan s'utilitzen per purificar aquestes mostres. A RPC, els dissolvents d’elució utilitzats es poden ordenar segons la seva polaritat: aigua <metanol <acetonitril <etanol <tetrahidrofuran <isopropanol. Per assegurar una bona retenció a la columna per a aquestes mostres (polar o altament hidrofílic), és necessària una elevada proporció del sistema aquós com a fase mòbil. Tanmateix, quan s’utilitza un sistema d’aigua pur (incloent aigua pura o solució de sal pura) com a fase mòbil, la llarga cadena de carboni de la fase estacionària de la columna C18 tendeix a evitar l’aigua i barrejar -se entre ells, donant lloc a una disminució instantània de la capacitat de retenció de la columna o fins i tot sense retenció. Aquest fenomen s’anomena “col·lapse de fase hidrofòbica” (com es mostra a la part esquerra de la figura 1). Tot i que aquesta situació és reversible quan la columna es renta amb dissolvents orgànics com el metanol o l’acetonitril, encara pot causar danys a la columna. Per tant, és necessari evitar que aquesta situació passi.
Figura 1. El diagrama esquemàtic de les fases unides a la superfície del gel de sílice a la columna C18 regular (esquerra) i la columna C18AQ (dreta).
Per solucionar els problemes esmentats anteriorment, els fabricants de materials d'embalatge cromatogràfics han millorat. Una d’aquestes millores és fer algunes modificacions a la superfície de la matriu de sílice, com la introducció de grups ciano hidròfils (com es mostra a la part dreta de la figura 1), per fer més hidrofílica la superfície del gel de sílice. Així, les cadenes C18 de la superfície de sílice es podrien estendre completament en condicions altament aquoses i es podria evitar el col·lapse de fase hidrofòbica. Aquestes columnes C18 modificades s’anomenen columnes aquoses C18, és a dir, columnes C18AQ, dissenyades per a condicions d’elució altament aquoses i poden tolerar el sistema 100% aquós. Les columnes C18AQ s’han aplicat àmpliament en la separació i purificació de compostos polars forts, inclosos àcids orgànics, pèptids, nucleòsids i vitamines solubles en aigua.
Desalting és una de les aplicacions típiques de les columnes C18AQ en la purificació de flaix per a mostres, que elimina els components de sal o tampó del dissolvent de la mostra per facilitar l’aplicació de la mostra en estudis posteriors. En aquesta publicació, es va utilitzar el brillant FCF blau amb una forta polaritat com a mostra i es va purificar a la columna C18AQ. El dissolvent de la mostra es va substituir per dissolvent orgànic a partir de la solució tampó, facilitant així la següent evaporació rotativa i estalviant dissolvents i temps de funcionament. A més, es va millorar la puresa de la mostra eliminant algunes impureses a la mostra.
Secció Experimental
Figura 2. L’estructura química de la mostra.
El brillant FCF blau es va utilitzar com a mostra en aquesta publicació. La puresa de la mostra crua va ser del 86% i l'estructura química de la mostra es va mostrar a la figura 2. Per preparar la solució de mostra, es va dissoldre 300 mg de cru en pols de FCF blau brillant en una solució tampó NaH2PO4 i va sacsejar bé per convertir -se en una solució completament clara. A continuació, es va injectar la solució de mostra a la columna Flash per un injector. La configuració experimental de la purificació de flaix es troba a la taula 1.
| Instrument | Màquina Sepabean ™2 | |||
| Cartutxos | 12 g de cartutx de flaix Sepaflash C18 RP (sílice esfèrica, 20-45 μm, 100 Å, número de comanda: SW-5222-012-SP) | 12 g de cartutx de flaix Sepaflash C18AQ RP (sílice esfèrica, 20-45 μm, 100 Å, número de comanda ： SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Longitud d'ona | 254 nm | |||
| Fase mòbil | Solvent A ： Aigua Solvent B ： Metanol | |||
| Velocitat de flux | 30 ml/min | |||
| Carrega de mostra | 300 mg (FCF blau brillant amb la puresa del 86%) | |||
| Gradient | Temps (CV) | Solvent B (%) | Temps (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultats i discussió
Es va utilitzar un cartutx de flaix SEPAFlash C18AQ RP per a la designació i la purificació de mostres. Es va utilitzar el gradient de pas en què es va utilitzar aigua pura com a fase mòbil a l'inici de l'elució i es va executar per a 10 volums de columnes (CV). Com es mostra a la figura 3, quan s’utilitza l’aigua pura com a fase mòbil, la mostra es va conservar completament al cartutx de flaix. A continuació, el metanol en fase mòbil es va incrementar directament fins al 100% i el gradient es va mantenir per 7,5 CV. La mostra es va eluir d’11,5 a 13,5 cv. En les fraccions recollides, la solució de mostra es va substituir de la solució tampó NAH2PO4 al metanol. En comparació amb una solució altament aquosa, el metanol es va eliminar molt més fàcilment per evaporació rotativa en el pas posterior, que facilita la investigació següent.
Figura 3. El cromatograma flash de la mostra en un cartutx C18AQ.
Per comparar el comportament de retenció del cartutx C18AQ i el cartutx C18 regular per a mostres de polaritat forta, es va realitzar una prova de comparació paral·lela. Es va utilitzar un cartutx de flaix SEPAFlash C18 RP i es va mostrar el cromatograma flash per a la mostra a la figura 4. Per a cartutxos regulars C18, la proporció de fase aquosa més tolerada és aproximadament del 90%. Per tant, el gradient d’inici es va establir al 10% de metanol en un 90% d’aigua. Tal com es mostra a la figura 4, a causa del col·lapse de fase hidrofòbica de les cadenes C18 causades per una elevada proporció aquosa, la mostra gairebé no es va conservar al cartutx C18 regular i es va eluir directament per la fase mòbil. Com a resultat, no es pot completar el funcionament de la destinació o la purificació de la mostra.
Figura 4. El cromatograma flash de la mostra en un cartutx C18 regular.
En comparació amb el gradient lineal, l’ús del gradient de pas té els avantatges següents:
1. Es redueix l’ús de dissolvents i el temps d’execució per a la purificació de mostres.
2. El producte objectiu elüta en un pic fort, que redueix el volum de fraccions recollides i facilita així la següent evaporació rotativa i també estalviant temps.
3. El producte recollit es troba en metanol que és fàcil d’evaporar, de manera que es redueix el temps d’assecat.
En conclusió, per a la purificació de la mostra que és fortament polar o altament hidrofílica, els cartutxos de flaix SEPAFlash C18AQ RP que combinen amb el sistema preparatiu de cromatografia flash Sepabean ™ podria oferir una solució ràpida i eficient.
Sobre els cartutxos de flaix de la Sèrie C18 RP de Sepaflash C18
Hi ha una sèrie de cartutxos de flaix RP RP SEPAFlash C18AQ amb diferents especificacions de la tecnologia Santai (com es mostra a la taula 2).
| Número d'article | Mida de la columna | Velocitat de flux (ml/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Taula 2. SePaflash C18AQ RP Cartutxos de flaix.
Materials d’embalatge: sílice c18 (aq) d’alta eficiència C18 (AQ), de 20 a 45 μm, 100 Å.
Logy (com es mostra a la taula 2).
Posat Post: 27 d'agost-2018