Rui Huang, Bo Xu
Primjena R&D centar
Uvod
Ionska izmjenjivačka hromatografija (IEC) je hromatografska metoda koja se obično koristi za odvajanje i prečišćavanje jedinjenja koja se nalaze u jonskom obliku u rastvoru.Prema različitim stanjima naboja izmjenjivih jona, IEC se može podijeliti na dva tipa, hromatografiju izmjenjivanja katjona i hromatografiju za izmjenu anjona.U hromatografiji izmjenjivanja katjona, kisele grupe su vezane za površinu medija za razdvajanje.Na primjer, sulfonska kiselina (-SO3H) je uobičajena grupa u jakoj kationskoj izmjeni (SCX), koja disocira H+ i negativno nabijena grupa -SO3- može tako adsorbirati druge katione u otopini.U hromatografiji za izmjenu anjona, alkalne grupe su vezane za površinu medija za razdvajanje.Na primjer, kvaternarni amin (-NR3OH, gdje je R ugljikovodična grupa) se obično koristi u jakoj anionskoj izmjeni (SAX), koja disocira OH-, a pozitivno nabijena grupa -N+R3 može adsorbirati druge anione u otopini, što rezultira anionom efekat razmene.
Među prirodnim proizvodima, flavonoidi su privukli pažnju istraživača zbog svoje uloge u prevenciji i liječenju kardiovaskularnih bolesti.Budući da su molekuli flavonoida kiseli zbog prisustva fenolnih hidroksilnih grupa, hromatografija ionske izmjene je alternativna opcija pored konvencionalne hromatografije normalne faze ili hromatografije obrnute faze za odvajanje i pročišćavanje ovih kiselih spojeva.U fleš hromatografiji, najčešće korišteni medij za odvajanje za jonsku izmjenu je matrica silika gela gdje su grupe za izmjenu jona vezane za njegovu površinu.Najčešći načini ionske izmjene u fleš hromatografiji su SCX (obično grupa sulfonske kiseline) i SAX (obično kvaternarna aminska grupa).U prethodno objavljenoj napomeni o prijavi pod naslovom “Primjena kolone za hromatografsku hromatografiju SepaFlash jake katjone u prečišćavanju alkalnih jedinjenja” kompanije Santai Technologies, SCX kolone su korištene za prečišćavanje alkalnih jedinjenja.U ovom postu, mješavina neutralnih i kiselih standarda korištena je kao uzorak za istraživanje primjene SAX kolona u prečišćavanju kiselih spojeva.
Eksperimentalna sekcija
Slika 1. Šematski dijagram stacionarne faze vezane za površinu medija za odvajanje SAX.
U ovom postu je korištena SAX kolona prethodno napunjena kvaternarnim aminom vezanim silicijum dioksidom (kao što je prikazano na slici 1).Smjesa kromona i 2,4-dihidroksibenzojeve kiseline korištena je kao uzorak za pročišćavanje (kao što je prikazano na slici 2).Smjesa je rastvorena u metanolu i napunjena na fleš uložak pomoću injektora.Eksperimentalna postavka fleš prečišćavanja navedena je u tabeli 1.
Slika 2. Hemijska struktura dvije komponente u mješavini uzorka.
| Instrument | SepaBean™ mašina T | |||||
| Cartridges | 4 g fleš kartridž SepaFlash Standard Series (nepravilan silicijum dioksid, 40 - 63 μm, 60 Å, broj narudžbe: S-5101-0004) | 4 g SepaFlash Bonded Series SAX flash uložak (nepravilan silicijum dioksid, 40 - 63 μm, 60 Å, broj narudžbe: SW-5001-004-IR) | ||||
| Talasna dužina | 254 nm (detekcija), 280 nm (nadgledanje) | |||||
| Mobilna faza | Rastvarač A: N-heksan | |||||
| Rastvarač B: Etil acetat | ||||||
| Brzina protoka | 30 mL/min | 20 mL/min | ||||
| Učitavanje uzorka | 20 mg (mješavina komponente A i komponente B) | |||||
| Gradijent | vrijeme (CV) | Rastvarač B (%) | vrijeme (CV) | Rastvarač B (%) | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 1.7 | 12 | 14 | 100 | |||
| 3.7 | 12 | / | / | |||
| 16 | 100 | / | / | |||
| 18 | 100 | / | / | |||
Rezultati i diskusija
Prvo, mješavina uzorka je odvojena pomoću fleš kartridža za normalnu fazu prethodno zapakovanog običnim silicijum dioksidom.Kao što je prikazano na slici 3, dvije komponente u uzorku su eluirane iz kertridža jedna za drugom.Zatim je za pročišćavanje uzorka korišten SAX fleš uložak.Kao što je prikazano na slici 4, kisela komponenta B je u potpunosti zadržana na SAX kertridžu.Neutralna komponenta A je postepeno eluirana iz uloška uz eluiranje mobilne faze.
Slika 3. Fleš hromatogram uzorka na običnom normalnom faznom kertridžu.
Slika 4. Flash hromatogram uzorka na SAX kertridžu.
Upoređujući slike 3 i 4, komponenta A ima nedosljedan oblik vrha na dva različita fleš kertridža.Da bismo potvrdili da li vrh elucije odgovara komponenti, možemo koristiti funkciju skeniranja pune talasne dužine koja je ugrađena u upravljački softver SepaBean™ mašine.Otvorite eksperimentalne podatke za dva razdvajanja, povucite do indikatorske linije na vremenskoj osi (CV) u kromatogramu do najviše tačke i druge najviše tačke eluacionog vrha koja odgovara komponenti A, i puni spektar talasnih dužina ove dve tačke će se automatski prikazati ispod hromatograma (kao što je prikazano na slikama 5 i 6).Upoređujući pune podatke o spektru talasne dužine ova dva odvajanja, komponenta A ima konzistentan apsorpcioni spektar u dva eksperimenta.Iz razloga što komponenta A ima nedosljedan oblik vrha na dva različita fleš kertridža, spekuliše se da postoji specifična nečistoća u komponenti A koja ima različito zadržavanje na kertridžu normalne faze i na SAX kertridžu.Stoga je sekvenca eluiranja različita za komponentu A i nečistoću na ova dva fleš uloška, što rezultira nedosljednim oblikom vrha na hromatogramima.
Slika 5. Puni spektar talasne dužine komponente A i nečistoće odvojene kertridžom normalne faze.
Slika 6. Puni spektar talasnih dužina komponente A i nečistoća odvojena SAX kertridžom.
Ako je ciljni proizvod koji treba prikupiti neutralna komponenta A, zadatak prečišćavanja se lako može završiti direktnom upotrebom SAX kertridža za eluiranje nakon punjenja uzorka.S druge strane, ako je ciljni proizvod koji treba prikupiti kisela komponenta B, način hvatanja-otpuštanja mogao bi se usvojiti uz samo neznatno podešavanje u eksperimentalnim koracima: kada je uzorak napunjen na SAX uložak i neutralnu komponentu A je potpuno eluiran sa normalnom fazom organskih rastvarača, prebacite mobilnu fazu u rastvor metanola koji sadrži 5% sirćetne kiseline.Joni acetata u mobilnoj fazi će se takmičiti sa komponentom B za vezivanje za kvaternarne aminske jonske grupe na stacionarnoj fazi SAX kertridža, čime će eluirati komponentu B iz uloška da bi se dobio ciljni proizvod.Na slici 7 prikazan je hromatogram uzorka odvojenog u modu ionske izmjene.
Slika 7. Fleš hromatogram komponente B eluirane u režimu jonske razmene na SAX kertridžu.
U zaključku, kiseli ili neutralni uzorak može se brzo pročistiti SAX kertridžom u kombinaciji sa kertridžom normalne faze koristeći različite strategije pročišćavanja.Nadalje, uz pomoć funkcije skeniranja pune valne dužine ugrađene u upravljački softver SepaBean™ mašine, karakterističan spektar apsorpcije eluiranih frakcija može se lako uporediti i potvrditi, pomažući istraživačima da brzo odrede sastav i čistoću eluiranih frakcija i na taj način poboljšaju efikasnost rada.
| Broj artikla | Column Size | Flow Rate (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5001-004-IR | 5,9 g | 10-20 | 400/27.5 |
| SW-5001-012-IR | 23 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5001-025-IR | 38 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5001-040-IR | 55 g | 20-40 | 400/27.5 |
| SW-5001-080-IR | 122 g | 30-60 | 350/24.0 |
| SW-5001-120-IR | 180 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5001-220-IR | 340 g | 50-100 | 300/20.7 |
| SW-5001-330-IR | 475 g | 50-100 | 250/17.2
|
Tabela 2. SepaFlash Bonded Series SAX fleš kertridži.Materijali pakovanja: Ultra-čisti nepravilni silicijum-dioksid vezani SAX, 40 - 63 μm, 60 Å.
Za dodatne informacije o detaljnim specifikacijama SepaBean™mašinu, ili informacije o narudžbi fleš kertridža SepaFlash serije, posetite našu veb stranicu.
Vrijeme objave: Nov-09-2018