Rui Huang, Bo Xu
Aplikacijski R&D centar
Uvod
Peptid je spoj sastavljen od aminokiselina, od kojih svaka ima jedinstvena fizička i hemijska svojstva zbog različitih tipova i reda aminokiselinskih ostataka koji čine njegov niz.Sa razvojem hemijske sinteze čvrste faze, hemijska sinteza različitih aktivnih peptida je postigla veliki napredak.Međutim, zbog komplikovanog sastava peptida dobijenog sintezom u čvrstoj fazi, konačni proizvod treba pročistiti pouzdanim metodama razdvajanja.Uobičajene metode pročišćavanja peptida uključuju hromatografiju ionske izmjene (IEC) i tečnu hromatografiju visokih performansi reverzne faze (RP-HPLC), koje imaju nedostatke kao što su niski kapacitet punjenja uzorka, visoka cijena medija za separaciju, komplikovana i skupa oprema za odvajanje, itd. Za brzo prečišćavanje peptida malih molekula (MW < 1 kDa), Santai Technologies je ranije objavio uspješan slučaj primjene, u kojem je SepaFlash RP C18 uložak korišten za brzo prečišćavanje timopentina (TP-5) i dobijen je ciljni proizvod koji ispunjava zahtjeve.
Slika 1. 20 uobičajenih aminokiselina (reprodukovano sa www.bachem.com).
Postoji 20 vrsta aminokiselina koje su uobičajene u sastavu peptida.Ove aminokiseline se mogu podijeliti u sljedeće grupe prema njihovom polaritetu i kiselinsko-baznom svojstvu: nepolarne (hidrofobne), polarne (nenabijene), kisele ili bazične (kao što je prikazano na slici 1).U peptidnoj sekvenci, ako su aminokiseline koje čine sekvencu uglavnom polarne (kao što je označeno ružičastom bojom na slici 1), kao što su cistein, glutamin, asparagin, serin, treonin, tirozin, itd., onda bi ovaj peptid mogao imati jaku polariteta i biti visoko rastvorljivi u vodi.Tokom postupka pročišćavanja ovih jakih polarnih peptidnih uzoraka hromatografijom obrnute faze, pojavit će se fenomen koji se zove kolaps hidrofobne faze (pogledajte prethodno objavljenu primjenu Santai Technologies: Hidrofobni fazni kolaps, AQ kolone hromatografije obrnute faze i njihove primjene).U poređenju sa redovnim C18 kolonama, poboljšane C18AQ kolone su najpogodnije za prečišćavanje jakih polarnih ili hidrofilnih uzoraka.U ovom postu, jak polarni peptid je korišten kao uzorak i pročišćen C18AQ kolonom.Kao rezultat, dobijen je ciljni proizvod koji ispunjava zahtjeve i može se koristiti u sljedećim istraživanjima i razvoju.
| Instrument | SepaBean™mašina 2 | |||
| Cartridges | 12 g SepaFlash C18 RP fleš uložak (sferični silicijum dioksid, 20 - 45 μm, 100 Å, broj narudžbe: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP fleš uložak (sferični silicijum dioksid, 20 - 45 μm, 100 Å, broj narudžbe: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Talasna dužina | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobilna faza | Rastvarač A: Voda Rastvarač B: acetonitril | |||
| Brzina protoka | 15 mL/min | 20 mL/min | ||
| Učitavanje uzorka | 30 mg | |||
| Gradijent | vrijeme (CV) | Rastvarač B (%) | vrijeme (min) | Rastvarač B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Rezultati i diskusija
Da bismo uporedili performanse prečišćavanja za uzorak polarnog peptida između redovne kolone C18 i kolone C18AQ, koristili smo redovnu kolonu C18 za brzo prečišćavanje uzorka kao početak.Kao što je prikazano na slici 2, zbog kolapsa hidrofobne faze lanaca C18 uzrokovanog visokim omjerom vode, uzorak se jedva zadržao na običnom C18 kertridžu i direktno je eluiran mobilnom fazom.Kao rezultat toga, uzorak nije bio efikasno odvojen i pročišćen.
Slika 2. Flash hromatogram uzorka na običnom C18 kertridžu.
Zatim smo koristili C18AQ kolonu za brzo prečišćavanje uzorka.Kao što je prikazano na slici 3, peptid je efektivno zadržan na koloni i zatim eluiran.Ciljni proizvod je odvojen od nečistoća u sirovom uzorku i sakupljen.Nakon liofilizacije i zatim analize pomoću HPLC, prečišćeni proizvod ima čistoću od 98,2% i može se dalje koristiti za sljedeći korak istraživanja i razvoja.
Slika 3. Flash hromatogram uzorka na C18AQ kertridžu.
U zaključku, SepaFlash C18AQ RP fleš kartridž u kombinaciji sa sistemom fleš hromatografije SepaBean™mašina bi mogla da ponudi brzo i efikasno rešenje za prečišćavanje jakih polarnih ili hidrofilnih uzoraka.
Postoji niz SepaFlash C18AQ RP fleš kertridža sa različitim specifikacijama kompanije Santai Technology (kao što je prikazano u tabeli 2).
| Broj artikla | Column Size | Flow Rate (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. SepaFlash C18AQ RP fleš kertridži.Materijali za pakovanje: Visokoefikasni sferični silicijum-dioksid vezan za C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
Za dodatne informacije o detaljnim specifikacijama SepaBean™ mašine, ili informacije o naručivanju fleš kertridža SepaFlash serije, posetite našu veb stranicu.
Vrijeme objave: 12.10.2018