Hongcheng Wang, Bo Xu
Aplikacijski R&D centar
Uvod
Prema relativnim polaritetima stacionarne faze i mobilne faze, tečna hromatografija se može podeliti na hromatografiju normalne faze (NPC) i hromatografiju reverzne faze (RPC).Za RPC, polaritet mobilne faze je jači od polariteta stacionarne faze.RPC je postao najrasprostranjeniji u načinima odvajanja tečne hromatografije zbog svoje visoke efikasnosti, dobre rezolucije i jasnog mehanizma zadržavanja.Stoga je RPC pogodan za odvajanje i pročišćavanje različitih polarnih ili nepolarnih jedinjenja, uključujući alkaloide, ugljikohidrate, masne kiseline, steroide, nukleinske kiseline, aminokiseline, peptide, proteine, itd. U RPC-u, najčešće korištena stacionarna faza je matriks silika gela koji je vezan za različite funkcionalne grupe, uključujući C18, C8, C4, fenil, cijano, amino, itd. Među ovim vezanim funkcionalnim grupama, najraširenija je C18.Procjenjuje se da više od 80% RPC-a sada koristi C18 spojenu fazu.Stoga je C18 kolona za hromatografiju postala obavezna univerzalna kolona za svaki laboratorij.
Iako se C18 kolona može koristiti u vrlo širokom rasponu primjena, međutim, za neke uzorke koji su vrlo polarni ili visoko hidrofilni, obične C18 kolone mogu imati problema kada se koriste za pročišćavanje takvih uzoraka.U RPC-u, najčešće korišteni otapala za eluiranje mogu se poredati prema njihovom polaritetu: voda < metanol < acetonitril < etanol < tetrahidrofuran < izopropanol.Da bi se osiguralo dobro zadržavanje na koloni za ove uzorke (jako polarne ili visoko hidrofilne), visok udio vodenog sistema je neophodan da se koristi kao mobilna faza.Međutim, kada se sistem čiste vode (uključujući čistu vodu ili čistu otopinu soli) koristi kao mobilnu fazu, dugi ugljični lanac na stacionarnoj fazi stupca C18 teži izbjegavanju vode i miješanju jedan s drugim, što rezultira trenutnim smanjenjem sposobnost zadržavanja kolone ili čak bez zadržavanja.Ovaj fenomen se naziva “hidrofobni fazni kolaps” (kao što je prikazano u lijevom dijelu slike 1).Iako je ova situacija reverzibilna kada se kolona ispere organskim rastvaračima kao što su metanol ili acetonitril, ona i dalje može uzrokovati oštećenje kolone.Stoga je neophodno spriječiti da se ova situacija dogodi.
Slika 1. Šematski dijagram vezanih faza na površini silika gela u redovnoj koloni C18 (lijevo) i C18AQ koloni (desno).
Kako bi se riješili gore navedeni problemi, proizvođači materijala za hromatografsko pakovanje napravili su tehnička poboljšanja.Jedno od ovih poboljšanja je izvođenje nekih modifikacija na površini silika matriksa, kao što je uvođenje hidrofilnih cijano grupa (kao što je prikazano u desnom dijelu slike 1), kako bi se površina silika gela učinila hidrofilnijom.Tako bi se lanci C18 na površini silicijum dioksida mogli u potpunosti proširiti u visoko vodenim uslovima i mogao bi se izbjeći kolaps hidrofobne faze.Ove modifikovane C18 kolone nazivaju se vodene C18 kolone, odnosno C18AQ kolone, koje su dizajnirane za visoko vodene uslove eluiranja i mogu tolerisati 100% vodeni sistem.C18AQ kolone su široko primijenjene u odvajanju i prečišćavanju jakih polarnih spojeva, uključujući organske kiseline, peptide, nukleozide i vitamine rastvorljive u vodi.
Odsoljavanje je jedna od tipičnih primjena C18AQ kolona u brzom prečišćavanju uzoraka, kojim se uklanjaju soli ili komponente pufera u rastvaraču uzorka kako bi se olakšala primjena uzorka u narednim studijama.U ovom postu, Brilliant Blue FCF sa jakim polaritetom je korišten kao uzorak i pročišćen na C18AQ koloni.Rastvarač uzorka je zamijenjen organskim rastvaračem iz puferske otopine, čime je olakšano sljedeće rotacijsko isparavanje, kao i ušteda rastvarača i vremena rada.Nadalje, čistoća uzorka je poboljšana uklanjanjem nekih nečistoća u uzorku.
Eksperimentalna sekcija
Slika 2. Hemijska struktura uzorka.
Brilliant Blue FCF je korišten kao uzorak u ovom postu.Čistoća sirovog uzorka bila je 86%, a hemijska struktura uzorka je prikazana na slici 2. Za pripremu rastvora uzorka, 300 mg praškaste sirove čvrste supstance Brilliant Blue FCF rastvoreno je u 1 M puferskom rastvoru NaH2PO4 i dobro protreseno da postane potpuno jasno rešenje.Otopina uzorka je zatim ubrizgana u fleš kolonu pomoću injektora.Eksperimentalna postavka fleš prečišćavanja navedena je u tabeli 1.
| Instrument | SepaBean™ mašina2 | |||
| Cartridges | 12 g SepaFlash C18 RP fleš uložak (sferični silicijum dioksid, 20 - 45 μm, 100 Å, broj narudžbe: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP fleš uložak (sferični silicijum dioksid, 20 - 45 μm, 100 Å, broj narudžbe: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Talasna dužina | 254 nm | |||
| Mobilna faza | Rastvarač A: Voda Rastvarač B: metanol | |||
| Brzina protoka | 30 mL/min | |||
| Učitavanje uzorka | 300 mg (Brilliant Blue FCF sa čistoćom od 86%) | |||
| Gradijent | vrijeme (CV) | Rastvarač B (%) | vrijeme (CV) | Rastvarač B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultati i diskusija
SepaFlash C18AQ RP fleš uložak je korišten za odsoljavanje i prečišćavanje uzoraka.Korišćen je stepenasti gradijent u kojem je čista voda korišćena kao mobilna faza na početku eluiranja i radila je 10 zapremina kolone (CV).Kao što je prikazano na slici 3, kada se koristi čista voda kao mobilna faza, uzorak je u potpunosti zadržan na fleš kertridžu.Zatim je metanol u mobilnoj fazi direktno povećan na 100% i gradijent je održavan za 7,5 CV.Uzorak je eluiran od 11,5 do 13,5 CV.U sakupljenim frakcijama, rastvor uzorka je zamenjen iz puferskog rastvora NaH2PO4 metanolom.U poređenju sa visoko vodenim rastvorom, metanol je bilo mnogo lakše ukloniti rotacionim isparavanjem u sledećem koraku, što olakšava sledeća istraživanja.
Slika 3. Flash hromatogram uzorka na C18AQ kertridžu.
Da bi se uporedilo ponašanje zadržavanja C18AQ kertridža i običnog C18 kertridža za uzorke jakog polariteta, izvršeno je paralelno poređenje.Korišćen je SepaFlash C18 RP fleš uložak i fleš hromatogram za uzorak je prikazan na slici 4. Za obične C18 kertridže, najveći tolerisani odnos vodene faze je oko 90%.Stoga je početni gradijent postavljen na 10% metanola u 90% vode.Kao što je prikazano na slici 4, zbog kolapsa hidrofobne faze lanaca C18 uzrokovanog visokim vodenim omjerom, uzorak se jedva zadržao na običnom C18 kertridžu i direktno je eluiran mobilnom fazom.Kao rezultat toga, operacija odsoljavanja ili pročišćavanja uzoraka ne može biti završena.
Slika 4. Flash hromatogram uzorka na običnom C18 kertridžu.
U poređenju sa linearnim gradijentom, upotreba stepenastog gradijenta ima sledeće prednosti:
1. Upotreba rastvarača i vrijeme rada za pročišćavanje uzorka je smanjeno.
2. Ciljni proizvod eluira u oštrom vrhu, što smanjuje volumen sakupljenih frakcija i na taj način olakšava sljedeće rotaciono isparavanje kao i uštedu vremena.
3. Sakupljeni proizvod je u metanolu koji se lako isparava, čime se smanjuje vrijeme sušenja.
Zaključno, za prečišćavanje uzorka koji je jako polaran ili visoko hidrofilan, SepaFlash C18AQ RP fleš kertridži u kombinaciji sa preparativnom fleš hromatografijom SepaBean™ Machine mogu ponuditi brzo i efikasno rešenje.
O fleš kertridžima SepaFlash Bonded C18 RP
Postoji niz SepaFlash C18AQ RP fleš kertridža sa različitim specifikacijama kompanije Santai Technology (kao što je prikazano u tabeli 2).
| Broj artikla | Veličina kolone | Flow Rate (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. SepaFlash C18AQ RP fleš kertridži.
Materijali za pakovanje: Visokoefikasni sferični silicijum-dioksid vezan za C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
(kao što je prikazano u tabeli 2).
Vrijeme objave: 27.08.2018