হংচেং ওয়াং, বো জু
আবেদন গবেষণা ও উন্নয়ন কেন্দ্র
ভূমিকা
স্থির ফেজ এবং মোবাইল ফেজের আপেক্ষিক পোলারিটি অনুসারে, তরল ক্রোমাটোগ্রাফিকে স্বাভাবিক ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি (NPC) এবং বিপরীত ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি (RPC) এ ভাগ করা যায়।RPC-এর জন্য, মোবাইল ফেজের পোলারিটি স্থির ফেজের চেয়ে শক্তিশালী।RPC তার উচ্চ দক্ষতা, ভাল রেজোলিউশন এবং পরিষ্কার ধারণ প্রক্রিয়ার কারণে তরল ক্রোমাটোগ্রাফি বিচ্ছেদ মোডগুলিতে সর্বাধিক ব্যবহৃত একটি হয়ে উঠেছে।তাই RPC অ্যালকালয়েড, কার্বোহাইড্রেট, ফ্যাটি অ্যাসিড, স্টেরয়েড, নিউক্লিক অ্যাসিড, অ্যামিনো অ্যাসিড, পেপটাইড, প্রোটিন ইত্যাদি সহ বিভিন্ন মেরু বা অ-পোলার যৌগগুলির পৃথকীকরণ এবং পরিশোধনের জন্য উপযুক্ত। RPC-তে, সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত স্থির ধাপ। সিলিকা জেল ম্যাট্রিক্স যা C18, C8, C4, ফিনাইল, সায়ানো, অ্যামিনো, ইত্যাদি সহ বিভিন্ন কার্যকরী গোষ্ঠীর সাথে আবদ্ধ।এটি অনুমান করা হয় যে RPC এর 80% এর বেশি এখন C18 বন্ডেড ফেজ ব্যবহার করছে।তাই C18 ক্রোমাটোগ্রাফি কলাম প্রতিটি পরীক্ষাগারের জন্য একটি সর্বজনীন কলামে পরিণত হয়েছে।
যদিও C18 কলাম অনেক বিস্তৃত অ্যাপ্লিকেশানে ব্যবহার করা যেতে পারে, তবে, কিছু নমুনার জন্য যা খুব পোলার বা অত্যন্ত হাইড্রোফিলিক, এই ধরনের নমুনাগুলিকে বিশুদ্ধ করতে ব্যবহার করার সময় নিয়মিত C18 কলামে সমস্যা হতে পারে।আরপিসি-তে, সাধারণত ব্যবহৃত ইলুশন দ্রাবকগুলি তাদের পোলারিটি অনুসারে অর্ডার করা যেতে পারে: জল < মিথানল < অ্যাসিটোনিট্রিল < ইথানল < টেট্রাহাইড্রোফুরান < আইসোপ্রোপ্যানল।এই নমুনাগুলির (শক্তিশালী পোলার বা উচ্চ হাইড্রোফিলিক) জন্য কলামে ভাল ধরে রাখার জন্য, জলীয় সিস্টেমের উচ্চ অনুপাত মোবাইল ফেজ হিসাবে ব্যবহার করা প্রয়োজন।যাইহোক, মোবাইল ফেজ হিসাবে বিশুদ্ধ জলের ব্যবস্থা (বিশুদ্ধ জল বা বিশুদ্ধ লবণের দ্রবণ সহ) ব্যবহার করার সময়, C18 কলামের স্থির পর্যায়ে দীর্ঘ কার্বন চেইন জল এড়াতে এবং একে অপরের সাথে মিশে যাওয়ার প্রবণতা রাখে, ফলে তাত্ক্ষণিকভাবে হ্রাস পায়। কলামের ধারণ ক্ষমতা বা এমনকি কোন ধারণ নেই।এই ঘটনাটিকে "হাইড্রোফোবিক ফেজ কোলাপস" বলা হয় (চিত্র 1 এর বাম অংশে দেখানো হয়েছে)।যদিও মিথানল বা অ্যাসিটোনিট্রিলের মতো জৈব দ্রাবক দিয়ে কলামটি ধুয়ে ফেলা হলে এই পরিস্থিতিটি বিপরীত হয়, তবুও এটি কলামের ক্ষতি করতে পারে।অতএব, এই পরিস্থিতি ঘটতে প্রতিরোধ করা প্রয়োজন।
চিত্র 1. নিয়মিত C18 কলামে (বাম) এবং C18AQ কলামে (ডানদিকে) সিলিকা জেলের পৃষ্ঠে বন্ডেড পর্যায়গুলির পরিকল্পিত চিত্র।
উপরে উল্লিখিত সমস্যাগুলি সমাধানের জন্য, ক্রোমাটোগ্রাফিক প্যাকিং উপকরণ নির্মাতারা প্রযুক্তিগত উন্নতি করেছে।এই উন্নতিগুলির মধ্যে একটি হল সিলিকা ম্যাট্রিক্সের পৃষ্ঠে কিছু পরিবর্তন করা, যেমন হাইড্রোফিলিক সায়ানো গ্রুপগুলির প্রবর্তন (চিত্র 1 এর ডান অংশে দেখানো হয়েছে), যাতে সিলিকা জেলের পৃষ্ঠকে আরও হাইড্রোফিলিক করা যায়।এইভাবে সিলিকা পৃষ্ঠের C18 চেইনগুলি অত্যন্ত জলীয় অবস্থার অধীনে সম্পূর্ণরূপে প্রসারিত হতে পারে এবং হাইড্রোফোবিক ফেজ পতন এড়ানো যেতে পারে।এই পরিবর্তিত C18 কলামগুলিকে জলীয় C18 কলাম বলা হয়, যথা C18AQ কলাম, যেগুলি অত্যন্ত জলীয় নির্গমন অবস্থার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে এবং 100% জলীয় সিস্টেম সহ্য করতে পারে।C18AQ কলামগুলি জৈব অ্যাসিড, পেপটাইড, নিউক্লিওসাইড এবং জলে দ্রবণীয় ভিটামিন সহ শক্তিশালী মেরু যৌগগুলির পৃথকীকরণ এবং বিশুদ্ধকরণে ব্যাপকভাবে প্রয়োগ করা হয়েছে।
নমুনার জন্য ফ্ল্যাশ বিশুদ্ধকরণে C18AQ কলামগুলির সাধারণ অ্যাপ্লিকেশনগুলির মধ্যে একটি হল ডিসল্টিং, যা পরবর্তী গবেষণায় নমুনা প্রয়োগের সুবিধার্থে নমুনা দ্রাবকের মধ্যে লবণ বা বাফার উপাদানগুলিকে সরিয়ে দেয়।এই পোস্টে, শক্তিশালী পোলারিটি সহ ব্রিলিয়ান্ট ব্লু FCF নমুনা হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং C18AQ কলামে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।নমুনা দ্রাবকটি বাফার দ্রবণ থেকে জৈব দ্রাবক দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়েছিল, এইভাবে নিম্নলিখিত ঘূর্ণমান বাষ্পীভবন এবং সেইসাথে দ্রাবক এবং অপারেটিং সময় সাশ্রয় করে।তদ্ব্যতীত, নমুনার কিছু অমেধ্য অপসারণ করে নমুনার বিশুদ্ধতা উন্নত করা হয়েছিল।
পরীক্ষামূলক অংশ
চিত্র 2. নমুনার রাসায়নিক গঠন।
এই পোস্টে নমুনা হিসেবে ব্রিলিয়ান্ট ব্লু এফসিএফ ব্যবহার করা হয়েছে।কাঁচা নমুনার বিশুদ্ধতা ছিল 86% এবং নমুনার রাসায়নিক গঠন চিত্র 2-এ দেখানো হয়েছে। নমুনা দ্রবণ প্রস্তুত করার জন্য, ব্রিলিয়ান্ট ব্লু FCF-এর 300 মিলিগ্রাম পাউডারি ক্রুড সলিড 1 M NaH2PO4 বাফার দ্রবণে দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং ভালভাবে ঝাঁকুনিতে পরিণত হয়েছিল। একটি সম্পূর্ণ পরিষ্কার সমাধান।নমুনা দ্রবণটি তখন একটি ইনজেক্টর দ্বারা ফ্ল্যাশ কলামে প্রবেশ করানো হয়েছিল।ফ্ল্যাশ পরিশোধনের পরীক্ষামূলক সেটআপটি টেবিল 1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।
| যন্ত্র | SepaBean™ মেশিন2 | |||
| কার্তুজ | 12 গ্রাম SepaFlash C18 RP ফ্ল্যাশ কার্টিজ (গোলাকার সিলিকা, 20 - 45 μm, 100 Å, অর্ডার নম্বর: SW-5222-012-SP) | 12 গ্রাম SepaFlash C18AQ RP ফ্ল্যাশ কার্টিজ (গোলাকার সিলিকা, 20 - 45 μm, 100 Å, অর্ডার নম্বর：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| তরঙ্গদৈর্ঘ্য | 254 এনএম | |||
| মোবাইল ফেজ | দ্রাবক A: জল দ্রাবক বি: মিথানল | |||
| প্রবাহ হার | 30 মিলি/মিনিট | |||
| নমুনা লোড হচ্ছে | 300 মিলিগ্রাম (86% বিশুদ্ধতার সাথে উজ্জ্বল নীল এফসিএফ) | |||
| গ্রেডিয়েন্ট | সময় (সিভি) | দ্রাবক বি (%) | সময় (সিভি) | দ্রাবক বি (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
ফলাফল এবং আলোচনা
একটি SepaFlash C18AQ RP ফ্ল্যাশ কার্টিজ নমুনা ডিসল্টিং এবং পরিশোধনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।স্টেপ গ্রেডিয়েন্ট ব্যবহার করা হয়েছিল যেখানে বিশুদ্ধ জলকে মোবাইল ফেজ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল ইলুশনের শুরুতে এবং 10 কলাম ভলিউমের (সিভি) জন্য চালানো হয়েছিল।চিত্র 3 এ দেখানো হয়েছে, মোবাইল ফেজ হিসাবে বিশুদ্ধ জল ব্যবহার করার সময়, নমুনাটি সম্পূর্ণরূপে ফ্ল্যাশ কার্টিজে ধরে রাখা হয়েছিল।এরপরে, মোবাইল ফেজে মিথানল সরাসরি 100% বৃদ্ধি করা হয়েছিল এবং গ্রেডিয়েন্টটি 7.5 সিভির জন্য বজায় রাখা হয়েছিল।নমুনাটি 11.5 থেকে 13.5 সিভি পর্যন্ত বের করা হয়েছে।সংগৃহীত ভগ্নাংশে, নমুনা সমাধানটি NaH2PO4 বাফার দ্রবণ থেকে মিথানলে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল।অত্যন্ত জলীয় দ্রবণের সাথে তুলনা করে, পরবর্তী ধাপে ঘূর্ণনশীল বাষ্পীভবনের মাধ্যমে মিথানল অপসারণ করা অনেক সহজ ছিল, যা নিম্নলিখিত গবেষণাকে সহজতর করে।
চিত্র 3. একটি C18AQ কার্টিজে নমুনার ফ্ল্যাশ ক্রোমাটোগ্রাম।
শক্তিশালী পোলারিটির নমুনার জন্য C18AQ কার্টিজ এবং নিয়মিত C18 কার্টিজের ধরে রাখার আচরণের তুলনা করতে, সমান্তরাল তুলনা পরীক্ষা করা হয়েছিল।একটি SepaFlash C18 RP ফ্ল্যাশ কার্টিজ ব্যবহার করা হয়েছিল এবং নমুনার জন্য ফ্ল্যাশ ক্রোমাটোগ্রাম চিত্র 4 এ দেখানো হয়েছে। নিয়মিত C18 কার্টিজের জন্য, সর্বোচ্চ সহনীয় জলীয় ফেজ অনুপাত প্রায় 90%।অতএব সূচনা গ্রেডিয়েন্ট 90% জলে 10% মিথানল সেট করা হয়েছিল।চিত্র 4-এ দেখানো হয়েছে, উচ্চ জলীয় অনুপাতের কারণে সৃষ্ট C18 চেইনের হাইড্রোফোবিক ফেজ পতনের কারণে, নমুনাটি সবেমাত্র নিয়মিত C18 কার্টিজে রাখা হয়েছিল এবং মোবাইল ফেজ দ্বারা সরাসরি বহিষ্কৃত হয়েছিল।ফলে স্যাম্পল ডিসল্টিং বা শোধনের কাজ শেষ করা যাচ্ছে না।
চিত্র 4. নিয়মিত C18 কার্টিজে নমুনার ফ্ল্যাশ ক্রোমাটোগ্রাম।
রৈখিক গ্রেডিয়েন্টের সাথে তুলনা করে, স্টেপ গ্রেডিয়েন্ট ব্যবহারের নিম্নলিখিত সুবিধা রয়েছে:
1. দ্রাবক ব্যবহার এবং নমুনা পরিশোধন জন্য রান সময় হ্রাস করা হয়.
2. লক্ষ্য পণ্যটি একটি তীক্ষ্ণ শিখরে নির্গত হয়, যা সংগৃহীত ভগ্নাংশের আয়তনকে হ্রাস করে এবং এইভাবে নিম্নলিখিত ঘূর্ণমান বাষ্পীভবনের পাশাপাশি সময় বাঁচাতে সহায়তা করে।
3. সংগৃহীত পণ্যটি মিথানলে থাকে যা বাষ্পীভূত করা সহজ, এইভাবে শুকানোর সময় হ্রাস পায়।
উপসংহারে, দৃঢ়ভাবে পোলার বা অত্যন্ত হাইড্রোফিলিক নমুনার বিশুদ্ধকরণের জন্য, SepaFlash C18AQ RP ফ্ল্যাশ কার্টিজ প্রস্তুতিমূলক ফ্ল্যাশ ক্রোমাটোগ্রাফি সিস্টেমের সাথে একত্রিত করে SepaBean™ মেশিন একটি দ্রুত এবং কার্যকর সমাধান দিতে পারে।
SepaFlash বন্ডেড সিরিজ C18 RP ফ্ল্যাশ কার্টিজ সম্পর্কে
সান্তাই টেকনোলজির বিভিন্ন স্পেসিফিকেশন সহ SepaFlash C18AQ RP ফ্ল্যাশ কার্টিজের একটি সিরিজ রয়েছে (সারণি 2 এ দেখানো হয়েছে)।
| আইটেম নম্বর | কলামের আকার | প্রবাহ হার (mL/মিনিট) | সর্বোচ্চ চাপ (psi/বার) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 গ্রাম | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 গ্রাম | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 গ্রাম | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 গ্রাম | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 গ্রাম | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 গ্রাম | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 গ্রাম | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 গ্রাম | 40-80 | 250/17.2 |
সারণি 2. SepaFlash C18AQ RP ফ্ল্যাশ কার্টিজ।
প্যাকিং উপকরণ: উচ্চ-দক্ষতা গোলাকার C18(AQ)-বন্ডেড সিলিকা, 20 - 45 μm, 100 Å।
লজি (টেবিল 2 এ দেখানো হয়েছে)।
পোস্ট সময়: আগস্ট-27-2018