Руи Хуанг, Бо Сю
Център за научноизследователска и развойна дейност
Въведение
Пептидът е съединение, съставено от аминокиселини, всяка от които има уникални физични и химични свойства поради различните видове и ред на аминокиселинните остатъци, съставляващи нейната последователност.С развитието на твърдофазния химичен синтез, химическият синтез на различни активни пептиди постигна голям напредък.Въпреки това, поради сложния състав на пептида, получен чрез синтез на твърда фаза, крайният продукт трябва да бъде пречистен чрез надеждни методи за разделяне.Често използваните методи за пречистване на пептиди включват йонообменна хроматография (IEC) и високоефективна течна хроматография с обърната фаза (RP-HPLC), които имат недостатъците на нисък капацитет на зареждане на пробата, висока цена на средата за разделяне, сложно и скъпо оборудване за разделяне, и т.н. За бързото пречистване на пептиди с малка молекула (MW < 1 kDa), успешен случай на приложение беше публикуван преди това от Santai Technologies, в който е използвана касета SepaFlash RP C18 за бързо пречистване на тимопентин (TP-5) и беше получен целевият продукт, отговарящ на изискванията.
Фигура 1. 20 често срещани аминокиселини (възпроизведени от www.bachem.com).
Има 20 вида аминокиселини, които са често срещани в състава на пептидите.Тези аминокиселини могат да бъдат разделени на следните групи според тяхната полярност и киселинно-основно свойство: неполярни (хидрофобни), полярни (незаредени), киселинни или основни (както е показано на фигура 1).В пептидна последователност, ако аминокиселините, съставляващи последователността, са предимно полярни (както е отбелязано в розов цвят на фигура 1), като цистеин, глутамин, аспарагин, серин, треонин, тирозин и т.н., тогава този пептид може да има силен полярност и е силно разтворим във вода.По време на процедурата за пречистване на тези силни полярни пептидни проби чрез хроматография с обърната фаза ще възникне явление, наречено колапс на хидрофобна фаза (вижте по-рано публикувана бележка за приложение от Santai Technologies: Колапс на хидрофобна фаза, колони за хроматография с обърната фаза AQ и техните приложения).В сравнение с обикновените колони C18, подобрените колони C18AQ са най-подходящи за пречистване на силно полярни или хидрофилни проби.В тази публикация силен полярен пептид беше използван като проба и пречистен с C18AQ колона.В резултат на това беше получен целевият продукт, отговарящ на изискванията, който може да се използва в следващите изследвания и разработки.
| Инструмент | SepaBean™машина 2 | |||
| патрони | 12 g SepaFlash C18 RP флаш касета (сферичен силициев диоксид, 20 - 45 μm, 100 Å, номер за поръчка: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP флаш касета (сферичен силициев диоксид, 20 - 45 μm, 100 Å, номер на поръчка: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Дължина на вълната | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Мобилна фаза | Разтворител А: Вода Разтворител В: Ацетонитрил | |||
| Дебит | 15 ml/мин | 20 ml/мин | ||
| Зареждане на проба | 30 мг | |||
| Градиент | Време (CV) | Разтворител B (%) | Време (мин) | Разтворител B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Резултати и дискусия
За да сравним ефективността на пречистване за полярната пептидна проба между обикновена C18 колона и C18AQ колона, ние използвахме обикновена C18 колона за бързо пречистване на пробата като начало.Както е показано на Фигура 2, поради колапса на хидрофобната фаза на веригите C18, причинен от високо водно съотношение, пробата едва се задържа върху обикновения патрон C18 и директно се елуира от подвижната фаза.В резултат на това пробата не е била ефективно отделена и пречистена.
Фигура 2. Флаш хроматограма на пробата върху обикновен патрон C18.
След това използвахме колона C18AQ за флаш пречистване на пробата.Както е показано на фигура 3, пептидът се задържа ефективно върху колоната и след това се елуира.Целевият продукт се отделя от примесите в суровата проба и се събира.След лиофилизация и след това анализиран с HPLC, пречистеният продукт има чистота от 98,2% и може да бъде допълнително използван за следващи етапи на изследване и развитие.
Фигура 3. Флаш хроматограма на пробата върху патрон C18AQ.
В заключение, флаш касета SepaFlash C18AQ RP, комбинирана с флаш хроматографската система SepaBean™машината може да предложи бързо и ефективно решение за пречистване на силно полярни или хидрофилни проби.
Има серия от флаш касети SepaFlash C18AQ RP с различни спецификации от Santai Technology (както е показано в таблица 2).
| Номер на артикул | Размер на колоната | Дебит (mL/min) | Макс.Налягане (psi/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 гр | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 гр | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 гр | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 гр | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 гр | 40-80 | 250/17.2 |
Таблица 2. Флаш касети SepaFlash C18AQ RP.Опаковъчни материали: Високоефективен сферичен C18(AQ)-свързан силициев диоксид, 20 - 45 μm, 100 Å.
За допълнителна информация относно подробните спецификации на машината SepaBean™ или информация за поръчка на флаш касети от серията SepaFlash, моля, посетете нашия уебсайт.
Време на публикуване: 12 октомври 2018 г