Hongcheng Wang, Bo Xu
Приложението за научноизследователска и развойна дейност
Въведение
Според относителните полярности на стационарната и подвижната фаза, течната хроматография може да бъде разделена на нормална фазова хроматография (NPC) и обърната фазова хроматография (RPC). За RPC полярността на подвижната фаза е по -силна от тази на неподвижната фаза. RPC се превърна в най -широко използвания в режимите на разделяне на течната хроматография поради високата си ефективност, добра разделителна способност и ясен механизъм за задържане. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, Циано, амино и др. Сред тези свързани функционални групи, най -широко използваната е C18. Изчислено е, че повече от 80% от RPC вече използват фаза, свързана с C18. Следователно колоната C18 хроматография се превърна в задължителна универсална колона за всяка лаборатория.
Въпреки че колоната C18 може да се използва в много широк спектър от приложения, за някои проби, които са много полярни или силно хидрофилни, редовните колони C18 могат да имат проблеми, когато се използват за пречистване на такива проби. В RPC често използваните разтворители на елуиране могат да бъдат подредени според тяхната полярност: вода <метанол <ацетонитрил <етанол <тетрахидрофуран <изопропанол. За да се осигури добро задържане на колоната за тези проби (силна полярна или силно хидрофилна), е необходим висок дял на водната система, за да се използва като подвижна фаза. Въпреки това, когато използвате чиста водна система (включително чиста вода или чист сол разтвор) като подвижна фаза, дългата въглеродна верига на стационарната фаза на колоната C18 има тенденция да избегне водата и да се смесва помежду си, което води до моментално намаляване на капацитета на задържане на колоната или дори без задържане. Това явление се нарича „хидрофобна фаза колапс“ (както е показано в лявата част на фигура 1). Въпреки че тази ситуация е обратима, когато колоната се промива с органични разтворители като метанол или ацетонитрил, тя все още може да причини увреждане на колоната. Следователно е необходимо да се предотврати тази ситуация.
Фигура 1. Схематичната диаграма на свързаните фази на повърхността на силикагел в редовна колона C18 (вляво) и C18AQ колона (вдясно).
За да се справят с горепосочените проблеми, производителите на хроматографски опаковъчни материали са направили технически подобрения. Едно от тези подобрения е да се направят някои модификации на повърхността на силициевия матрица, като въвеждането на хидрофилни циано групи (както е показано в дясната част на фигура 1), за да се направи повърхността на силициевия гел по -хидрофилна. По този начин веригите C18 на повърхността на силициев диоксид могат да бъдат напълно удължени при силно водни условия и може да се избегне хидрофобният фазов срив. Тези модифицирани колони C18 се наричат водни колони C18, а именно колони C18AQ, които са проектирани за силно водни елуиращи условия и могат да понасят 100% водна система. C18AQ колоните са широко приложени при разделянето и пречистването на силни полярни съединения, включително органични киселини, пептиди, нуклеозиди и водоразтворими витамини.
Обясването е едно от типичните приложения на колоните C18AQ в пречистването на светкавицата за проби, което премахва компонентите на солта или буфера в разтвора на пробата, за да улесни прилагането на пробата в следващите проучвания. В този пост блестящият син FCF със силна полярност се използва като проба и пречистен на колоната C18AQ. Пробата разтворител се заменя с органичен разтворител от буферен разтвор, като по този начин се улеснява следното ротационно изпаряване, както и спестяването на разтворители и времето за работа. Освен това, чистотата на пробата се подобрява чрез отстраняване на някои примеси в пробата.
Експериментален раздел
Фигура 2. Химическата структура на пробата.
Блестящият син FCF беше използван като проба в този пост. Чистотата на суровата проба е 86% и химическата структура на пробата е показана на фигура 2. За приготвяне на разтвора на пробата, 300 mg прахообразно сурово твърдо вещество от блестящ син FCF се разтваря в 1 m NAH2PO4 буферен разтвор и се разклаща добре, за да се превърне в напълно ясен разтвор. След това разтворът на пробата се инжектира в колоната на флаш чрез инжектор. Експерименталната настройка на пречистването на светкавицата е посочена в таблицата 1.
| Инструмент | Машина Sepabean ™2 | |||
| Патрони | 12 g Sepaflash C18 RP флаш касета (сферичен силициев диоксид, 20-45 μm, 100 Å, номер на поръчка: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP флаш касета (сферичен силициев диоксид, 20-45 μm, 100 Å, номер на поръчка: SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Дължина на вълната | 254 nm | |||
| Мобилна фаза | Разтворител A: вода Разтворител B: Метанол | |||
| Дебит | 30 ml/min | |||
| Зареждане на пробата | 300 mg (блестящ син FCF с чистота 86%) | |||
| Градиент | Време (CV) | Разтворител В (%) | Време (CV) | Разтворител В (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Резултати и дискусия
За проба за обезсоляване и пречистване и пречистване се използва Sepaflash C18AQ RP флаш касета. Използва се градиентът на стъпката, при който чистата вода се използва като подвижна фаза в началото на елуирането и се изпълнява за 10 колони (CV). Както е показано на фигура 3, когато се използва чиста вода като подвижна фаза, пробата се запазва напълно върху флаш касетата. След това метанолът в подвижната фаза се увеличава директно до 100% и градиентът се поддържа за 7,5 CV. Пробата се елуира от 11,5 до 13,5 cv. В събраните фракции разтворът на пробата се заменя от NAH2PO4 буферен разтвор на метанол. Сравнявайки с силно воден разтвор, метанолът беше много по -лесно да се отстрани чрез ротационно изпаряване в следващата стъпка, което улеснява следните изследвания.
Фигура 3. Флаш хроматограмата на пробата върху касета C18AQ.
За да се сравни поведението на задържане на касета C18AQ и редовен касета C18 за проби от силна полярност, беше извършен тест за паралелно сравнение. Използвана е флаш касета Sepaflash C18 RP и флаш хроматограмата за пробата е показана на фигура 4. За редовни касети C18 най -високо поносимият воден фазов съотношение е около 90%. Следователно стартовият градиент се определя на 10% метанол в 90% вода. Както е показано на фигура 4, поради хидрофобния фазов срив на веригите C18, причинени от високо водно съотношение, пробата едва се задържа на обикновената касета C18 и се елуира директно от подвижната фаза. В резултат на това не може да бъде завършена експлоатацията на обезсоляване или пречистване на пробата.
Фигура 4. Флаш хроматограмата на пробата на редовен касета C18.
Сравнявайки с линеен градиент, използването на градиент на стъпката има следните предимства:
1. Използването на разтворители и времето за изпълнение за пречистване на пробата се намалява.
2. Целевият продукт се елитира в рязък пик, което намалява обема на събраните фракции и по този начин улеснява следното ротационно изпаряване, както и спестяване на време.
3. Събраният продукт е в метанол, който е лесно да се изпари, като по този начин времето за сушене се намалява.
В заключение, за пречистването на пробата, която е силно полярна или силно хидрофилна, флаш касети на Sepaflash C18AQ RP, комбиниращи се с подготвителната система за флаш хроматография Sepabean ™ може да предложи бързо и ефективно решение.
Относно флаш касетите C18 RP Sepaflash
Има поредица от флаш касетите на Sepaflash C18AQ RP с различни спецификации от технологията Santai (както е показано в таблица 2).
| Номер на артикула | Размер на колоната | Дебит (ml/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Таблица 2. Sepaflash C18AQ RP флаш касети.
Опаковъчни материали: Сферична сферична С18 (AQ) силициев диоксид, 20-45 μm, 100 Å.
Логия (както е показано в таблица 2).
Време за публикация: 27-2018 август