Hongcheng Wang, Bo Xu
Център за научноизследователска и развойна дейност
Въведение
Според относителните полярности на стационарната фаза и подвижната фаза, течната хроматография може да бъде разделена на нормална фазова хроматография (NPC) и обърната фазова хроматография (RPC).За RPC полярността на мобилната фаза е по-силна от тази на стационарната фаза.RPC се превърна в най-широко използвания в режимите на разделяне на течна хроматография поради своята висока ефективност, добра разделителна способност и ясен механизъм за задържане.Следователно RPC е подходящ за разделяне и пречистване на различни полярни или неполярни съединения, включително алкалоиди, въглехидрати, мастни киселини, стероиди, нуклеинови киселини, аминокиселини, пептиди, протеини и др. В RPC най-често използваната стационарна фаза е матрицата на силикагела, която е свързана с различни функционални групи, включително С18, С8, С4, фенил, циано, амино и т.н. Сред тези свързани функционални групи най-широко използваната е С18.Изчислено е, че повече от 80% от RPC сега използват C18 свързана фаза.Следователно хроматографската колона C18 се превърна в задължителна универсална колона за всяка лаборатория.
Въпреки че колона C18 може да се използва в много широк диапазон от приложения, обаче, за някои проби, които са много полярни или силно хидрофилни, обикновените колони C18 може да имат проблеми, когато се използват за пречистване на такива проби.В RPC често използваните разтворители за елуиране могат да бъдат подредени според тяхната полярност: вода < метанол < ацетонитрил < етанол < тетрахидрофуран < изопропанол.За да се осигури добро задържане върху колоната за тези проби (силно полярни или силно хидрофилни), е необходимо високо съотношение на водната система да се използва като подвижна фаза.Въпреки това, когато се използва система с чиста вода (включително чиста вода или чист солен разтвор) като подвижна фаза, дългата въглеродна верига на стационарната фаза на колоната C18 има тенденция да избягва водата и да се смесва една с друга, което води до моментално намаляване на капацитет на задържане на колоната или дори липса на задържане.Това явление се нарича "хидрофобна фаза колапс" (както е показано в лявата част на фигура 1).Въпреки че тази ситуация е обратима, когато колоната се промие с органични разтворители като метанол или ацетонитрил, тя все още може да причини повреда на колоната.Ето защо е необходимо да се предотврати тази ситуация.
Фигура 1. Схематична диаграма на свързаните фази на повърхността на силикагел в обикновена колона C18 (вляво) и колона C18AQ (вдясно).
За да се справят с гореспоменатите проблеми, производителите на хроматографски опаковъчни материали са направили технически подобрения.Едно от тези подобрения е извършването на някои модификации на повърхността на матрицата от силициев диоксид, като например въвеждането на хидрофилни циано групи (както е показано в дясната част на Фигура 1), за да се направи повърхността на силикагела по-хидрофилна.По този начин веригите C18 на повърхността на силициевия диоксид могат да бъдат напълно удължени при силно водни условия и колапсът на хидрофобната фаза може да бъде избегнат.Тези модифицирани C18 колони се наричат водни C18 колони, а именно C18AQ колони, които са проектирани за условия на силно водно елуиране и могат да понасят 100% водна система.Колоните C18AQ са широко използвани при разделянето и пречистването на силни полярни съединения, включително органични киселини, пептиди, нуклеозиди и водоразтворими витамини.
Обезсоляването е едно от типичните приложения на колони C18AQ при мигновено пречистване на проби, което премахва солта или буферните компоненти в разтворителя на пробата, за да се улесни прилагането на пробата в следващите изследвания.В тази публикация Brilliant Blue FCF със силна полярност беше използван като проба и пречистен в колона C18AQ.Разтворителят на пробата беше заменен с органичен разтворител от буферен разтвор, като по този начин се улесни последващото ротационно изпаряване, както и спестяване на разтворители и време за работа.Освен това, чистотата на пробата беше подобрена чрез отстраняване на някои примеси в пробата.
експериментална секция
Фигура 2. Химическа структура на пробата.
Brilliant Blue FCF беше използван като проба в тази публикация.Чистотата на суровата проба е 86% и химическата структура на пробата е показана на фигура 2. За да се подготви разтворът на пробата, 300 mg прахообразно сурово твърдо вещество от Brilliant Blue FCF се разтварят в 1 М NaH2PO4 буферен разтвор и се разклаща добре, за да стане напълно ясно решение.Разтворът на пробата след това се инжектира във флаш колоната чрез инжектор.Експерименталната настройка на флаш пречистването е посочена в таблица 1.
| Инструмент | Машина SepaBean™2 | |||
| патрони | 12 g SepaFlash C18 RP флаш касета (сферичен силициев диоксид, 20 - 45 μm, 100 Å, номер на поръчка: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP флаш касета (сферичен силициев диоксид, 20 - 45 μm, 100 Å, номер на поръчка: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Дължина на вълната | 254 nm | |||
| Мобилна фаза | Разтворител А: вода Разтворител B: метанол | |||
| Дебит | 30 ml/мин | |||
| Зареждане на проба | 300 mg (Brilliant Blue FCF с чистота 86%) | |||
| Градиент | Време (CV) | Разтворител B (%) | Време (CV) | Разтворител B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Резултати и дискусия
За обезсоляване и пречистване на пробата беше използвана флаш касета SepaFlash C18AQ RP.Използва се стъпков градиент, при който чистата вода се използва като подвижна фаза в началото на елуирането и се провежда за 10 колонни обема (CV).Както е показано на фигура 3, когато се използва чиста вода като подвижна фаза, пробата се задържа изцяло върху флаш касетата.След това метанолът в подвижната фаза беше директно увеличен до 100% и градиентът беше поддържан за 7,5 CV.Пробата се елуира от 11,5 до 13,5 CV.В събраните фракции разтворът на пробата беше заменен от буферен разтвор на NaH2PO4 с метанол.В сравнение с високо водния разтвор, метанолът беше много по-лесен за отстраняване чрез ротационно изпаряване в следващия етап, което улеснява следващите изследвания.
Фигура 3. Флаш хроматограма на пробата върху патрон C18AQ.
За да се сравни поведението на задържане на патрон C18AQ и обикновен патрон C18 за проби със силна полярност, беше извършен тест за паралелно сравнение.Използва се флаш патрон SepaFlash C18 RP и флаш хроматограмата за пробата е показана на Фигура 4. За обикновени патрони C18 най-високото допустимо съотношение на водната фаза е около 90%.Следователно началният градиент беше зададен на 10% метанол в 90% вода.Както е показано на фигура 4, поради колапса на хидрофобната фаза на веригите C18, причинен от високо водно съотношение, пробата едва се задържа върху обикновения патрон C18 и директно се елуира от подвижната фаза.В резултат на това операцията по обезсоляване или пречистване на пробата не може да бъде завършена.
Фигура 4. Флаш хроматограма на пробата върху обикновен патрон C18.
В сравнение с линейния градиент, използването на стъпков градиент има следните предимства:
1. Използването на разтворител и времето за пречистване на пробата са намалени.
2. Целевият продукт се елуира с остър пик, което намалява обема на събраните фракции и по този начин улеснява последващото ротационно изпаряване, както и спестява време.
3. Събраният продукт е в метанол, който лесно се изпарява, като по този начин времето за сушене се намалява.
В заключение, за пречистване на проба, която е силно полярна или силно хидрофилна, флаш касетите SepaFlash C18AQ RP, комбинирани с препаративната флаш хроматографска система SepaBean™ Machine, могат да предложат бързо и ефективно решение.
За флаш касетите SepaFlash Bonded Series C18 RP
Има серия от флаш касети SepaFlash C18AQ RP с различни спецификации от Santai Technology (както е показано в таблица 2).
| Номер на артикул | Размер на колоната | Дебит (mL/min) | Макс.Налягане (psi/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 гр | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 гр | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 гр | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 гр | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 гр | 40-80 | 250/17.2 |
Таблица 2. Флаш касети SepaFlash C18AQ RP.
Опаковъчни материали: Високоефективен сферичен C18(AQ)-свързан силициев диоксид, 20 - 45 μm, 100 Å.
логика (както е показано в таблица 2).
Време на публикуване: 27 август 2018 г