Hongcheng Wang, Bo Xu
Дадатак R&D Center
Уводзіны
У адпаведнасці з адноснымі палярнасцю стацыянарнай фазы і мабільнай фазы, вадкасную храматаграфію можна падзяліць на нармальную фазавую храматаграфію (NPC) і зваротную фазавую храматаграфію (RPC). Для RPC палярнасць мабільнай фазы мацней, чым у стацыянарнай фазе. RPC стаў найбольш шырока выкарыстоўваным у рэжымах падзелу вадкаснай храматаграфіі з -за высокай эфектыўнасці, добрага дазволу і празрыстага механізму ўтрымання. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, Cyano, Amino і г.д. Сярод гэтых звязаных функцыянальных груп найбольш шырока выкарыстоўваецца C18. Паводле ацэнак, больш за 80% RPC зараз выкарыстоўваюць фазу C18. Таму слупка храматаграфіі C18 стала абавязковай універсальнай калонкай для кожнай лабараторыі.
Хоць слупок C18 можа быць выкарыстаны ў вельмі шырокім дыяпазоне прыкладанняў, для некаторых узораў, якія вельмі палярныя або вельмі гідрафільныя, звычайныя слупкі C18 могуць мець праблемы пры выкарыстанні для ачысткі такіх узораў. У RPC звычайна выкарыстоўваюцца элюіравальныя растваральнікі можна ўпарадкавацца ў адпаведнасці з іх палярнасцю: вада <метанол <ацетонітрыл <этанол <тэтрагідрафуран <ізапрапанол. Каб забяспечыць добрае ўтрыманне на калоне для гэтых узораў (моцныя палярныя або высока гідрафільныя), у якасці мабільнай фазы неабходна выкарыстоўваць высокую долю воднай сістэмы. Аднак, выкарыстоўваючы чыстую водную сістэму (уключаючы чыстую ваду або чысты раствор солі) у якасці мабільнай фазы, доўгі вугляродны ланцужок на стацыянарнай фазе калонкі С18 мае тэндэнцыю пазбягаць вады і змешвацца адзін з адным, што прыводзіць да імгненнага зніжэння магутнасці ўтрымання калоны і нават без затрымання. Гэты феномен называецца "гідрафобным фазавым калапсам" (як паказана ў левай частцы малюнка 1). Хоць такая сітуацыя зварачальная, калі калона прамываюць арганічнымі растваральнікамі, такімі як метанол або ацетонітрыл, яна ўсё яшчэ можа прывесці да пашкоджання калоны. Таму неабходна прадухіліць гэтую сітуацыю.
Малюнак 1. Схематычная схема звязаных фаз на паверхні сілікагеля ў звычайнай калонцы C18 (злева) і слупку C18AQ (справа).
Для вырашэння вышэйзгаданых праблем вытворцы храматаграфічных упаковачных матэрыялаў зрабілі тэхнічныя паляпшэнні. Адным з такіх паляпшэнняў з'яўляецца ўнясенне некаторых мадыфікацый на паверхні матрыцы крэмнія, напрыклад, увядзенне гідрафільных груп циано (як паказана ў правай частцы малюнка 1), каб зрабіць паверхню геля крэмнія больш гідрафільнай. Такім чынам, ланцугі С18 на паверхні крэмнія могуць быць цалкам пашыраны ў высока водных умовах, і гідрафобную фазу можна пазбегнуць. Гэтыя мадыфікаваныя слупкі C18 называюцца воднымі слупамі C18, а менавіта C18AQ, якія прызначаны для высока водных умоў элюіравання і могуць пераносіць 100% водную сістэму. Калоны C18AQ шырока ўжываюцца пры падзеле і ачышчэнні моцных палярных злучэнняў, уключаючы арганічныя кіслоты, пептыды, нуклеазіды і растваральныя ў вадзе вітаміны.
Ачыстка - адно з тыповых прымянення слупкоў C18AQ у ачыстцы ўспышкі для ўзораў, якая выдаляе кампаненты солі або буфера ў растваральніку ўзору, каб палегчыць прымяненне ўзору ў наступных даследаваннях. У гэтым пасце быў выкарыстаны бліскучы сіні FCF з моцнай палярнасцю ў якасці ўзору і вычышчаны на слупку C18AQ. Выбарны растваральнік быў заменены арганічным растваральнікам з буфернага раствора, што палягчае наступнае паваротнае выпарэнне, а таксама захаванне растваральнікаў і час працы. Акрамя таго, чысціня ўзору паляпшалася, выдаляючы некаторыя прымешкі ў пробе.
Эксперыментальны раздзел
Малюнак 2. Хімічная структура ўзору.
Бліскучы сіні FCF быў выкарыстаны ў якасці ўзору ў гэтым пасце. Чысціня неапрацаванага ўзору склала 86%, а хімічная структура ўзору была паказана на малюнку 2. Для падрыхтоўкі раствора ўзору 300 мг раскошнай сырой цвёрдай цвёрдага сіняга FCF растваралі ў буферы 1 M NAH2PO4 і добра пахіснуліся, каб стаць цалкам выразным растворам. Затым раствор пробы ўводзілі ў флэш -калонку інжэктарам. Эксперыментальная ўстаноўка ачысткі ўспышкі прыведзены ў табліцы 1.
| Прылада | Машына Sepabean ™2 | |||
| Картрыджы | 12 G Sepaflash C18 RP Flash Partridge (сферычны крэмній, 20-45 мкм, 100 Å, нумар замовы: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP Flash Partridge (сферычны крэмній, 20-45 мкм, 100 Å, нумар замовы: SW-5222-012-SP (AQ (AQ)） | ||
| Даўжыня хвалі | 254 нм | |||
| Мабільная фаза | Растваральнік A: Вада Растваральнік B: метанол | |||
| Расход | 30 мл/мін | |||
| Узор загрузкі | 300 мг (бліскучы сіні FCF з чысцінёй 86%) | |||
| Градыянт | Час (рэзюмэ) | Растваральнік B (%) | Час (рэзюмэ) | Растваральнік B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Вынікі і абмеркаванне
Для ўзору і ачышчэння выкарыстоўваўся флэш -картрыдж Sepaflash C18AQ RP. Крок градыент быў выкарыстаны, у якім чыстая вада выкарыстоўвалася ў якасці мабільнай фазы ў пачатку элюіравання і запусціце 10 аб'ёмаў слупкоў (CV). Як паказана на малюнку 3, пры выкарыстанні чыстай вады ў якасці мабільнай фазы, узор цалкам захоўваецца на флэш -картрыджы. Далей метанол у мабільнай фазе непасрэдна павялічыўся да 100%, а градыент падтрымліваўся за 7,5 CV. Узор быў элюіраваны з 11,5 да 13,5 CV. У сабраных фракцыях раствор пробы замянілі з буфера NAH2PO4 да метанолу. У параўнанні з высокім водным растворам, метанолу было значна прасцей выдаліць паваротным выпарэннем на наступным этапе, што палягчае наступныя даследаванні.
Малюнак 3. Флэш -храматаграма ўзору на картрыджы C18AQ.
Для параўнання паводзін утрымання картрыджа C18AQ і звычайнага картрыджа C18 для ўзораў моцнай палярнасці быў праведзены паралельны тэст параўнання. Быў выкарыстаны флэш -картрыдж Sepaflash C18 RP, і флэш -храматаграма для ўзору была паказана на малюнку 4. Для звычайных картрыджаў C18 найбольшае пераноснае стаўленне воднай фазы складае каля 90%. Таму градыент запуску быў усталяваны ў 10% метанолу ў 90% вадзе. Як паказана на малюнку 4, з -за гідрафобнай фазы калапсу ланцугоў С18, выкліканага высокім водным суадносінамі, узор практычна не захоўваўся на звычайным картрыджы С18 і быў непасрэдна элюіраваны мабільнай фазай. У выніку працы ўзору або ачышчэння не могуць быць завершаны.
Малюнак 4. Флэш -храматаграма ўзору на звычайным картрыджы C18.
У параўнанні з лінейным градыентам, выкарыстанне градыенту кроку мае наступныя перавагі:
1. Выкарыстанне растваральніка і час запуску для ачысткі ўзораў памяншаецца.
2. Мэтавы прадукт элюнуе ў рэзкім піку, які памяншае аб'ём сабраных фракцый і, такім чынам, палягчае наступнае паваротнае выпарэнне, а таксама эканоміць час.
3. Сабраны прадукт знаходзіцца ў метаноле, які лёгка выпарыцца, таму час высыхання памяншаецца.
У заключэнне, для ачысткі ўзору, якая моцна палярная або вельмі гідрафільная, Sepaflash C18AQ RP Flash -картрыджы, якія спалучаюцца з падрыхтоўчай сістэмай флэш -храматаграфіі Sepabean ™, могуць прапанаваць хуткае і эфектыўнае рашэнне.
Аб серыях Sepaflash серыі C18 RP Flash патроны
Існуе шэраг флэш -картрыджаў Sepaflash C18AQ RP з рознымі характарыстыкамі тэхналогіі Santai (як паказана ў табліцы 2).
| Нумар прадмета | Памер калонкі | Расход (мл/мін) | Max.pressure (PSI/BAR) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 г | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 г | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 г | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 г | 40-80 | 250/17.2 |
Табліца 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Catridges.
Упаковачныя матэрыялы: высокаэфектыўная сферычная C18 (aq) -мбаваная крэмній, 20-45 мкм, 100 Å.
Логія (як паказана ў табліцы 2).
Час паведамлення: 27 жніўня 2018 г.