Hongcheng Wang, Bo Xu
Tətbiq Ar-Ge Mərkəzi
Giriş
Stasionar fazanın və mobil fazanın nisbi qütblərinə görə maye xromatoqrafiyanı normal faza xromatoqrafiyasına (NPC) və tərs faza xromatoqrafiyasına (RPC) bölmək olar.RPC üçün mobil fazanın polaritesi stasionar fazadan daha güclüdür.RPC yüksək effektivliyi, yaxşı həlli və aydın tutma mexanizmi sayəsində maye xromatoqrafiya ayırma rejimlərində ən çox istifadə edilən birinə çevrilmişdir.Buna görə də RPC müxtəlif qütblü və ya qeyri-polyar birləşmələrin, o cümlədən alkaloidlər, karbohidratlar, yağ turşuları, steroidlər, nuklein turşuları, amin turşuları, peptidlər, zülallar və s. ayrılması və təmizlənməsi üçün uyğundur. RPC-də ən çox istifadə edilən stasionar fazadır. müxtəlif funksional qruplarla, o cümlədən C18, C8, C4, fenil, siyano, amin və s. ilə bağlanmış silika gel matrisi. Bu birləşdirilmiş funksional qruplar arasında ən çox istifadə ediləni C18-dir.Hazırda RPC-nin 80%-dən çoxunun C18 bağlı fazadan istifadə etdiyi təxmin edilir.Beləliklə, C18 xromatoqrafiya sütunu hər bir laboratoriya üçün universal bir sütuna çevrildi.
Baxmayaraq ki, C18 sütunu çox geniş tətbiqlərdə istifadə oluna bilər, lakin çox qütblü və ya yüksək hidrofilik olan bəzi nümunələr üçün adi C18 sütunları belə nümunələri təmizləmək üçün istifadə edilərkən problemlər yarana bilər.RPC-də ümumi istifadə olunan elüsyon həllediciləri polaritesinə görə sıralana bilər: su < metanol < asetonitril < etanol < tetrahidrofuran < izopropanol.Bu nümunələr üçün (güclü qütblü və ya yüksək hidrofilik) sütunda yaxşı saxlanmasını təmin etmək üçün sulu sistemin yüksək nisbətinin mobil faza kimi istifadə edilməsi lazımdır.Bununla belə, təmiz su sistemindən (təmiz su və ya təmiz duz məhlulu daxil olmaqla) mobil faza kimi istifadə edildikdə, C18 sütununun stasionar fazasındakı uzun karbon zənciri sudan qaçmağa və bir-biri ilə qarışmağa meyllidir, nəticədə suda ani azalma olur. sütunun tutma qabiliyyəti və ya hətta tutulmaması.Bu fenomen "hidrofobik fazanın çökməsi" adlanır (Şəkil 1-in sol hissəsində göstərildiyi kimi).Sütun metanol və ya asetonitril kimi üzvi həlledicilərlə yuyulduqda bu vəziyyət geri qaytarılsa da, yenə də sütunun zədələnməsinə səbəb ola bilər.Ona görə də bu vəziyyətin baş verməsinin qarşısını almaq lazımdır.
Şəkil 1. Adi C18 sütununda (solda) və C18AQ sütununda (sağda) silisium gelinin səthində birləşdirilmiş fazaların sxematik diaqramı.
Yuxarıda göstərilən problemləri həll etmək üçün xromatoqrafik qablaşdırma materialları istehsalçıları texniki təkmilləşdirmələr apardılar.Bu təkmilləşdirmələrdən biri silisium matrisinin səthində bəzi dəyişikliklərin edilməsidir, məsələn, hidrofilik siyano qruplarının tətbiqi (Şəkil 1-in sağ hissəsində göstərildiyi kimi) silisium gelin səthini daha hidrofilik etməkdir.Beləliklə, silisium səthindəki C18 zəncirləri yüksək sulu şəraitdə tam olaraq uzadıla bilər və hidrofobik fazanın dağılmasının qarşısını almaq olar.Bu dəyişdirilmiş C18 sütunları sulu C18 sütunları adlanır, yəni C18AQ sütunları yüksək sulu elüsyon şəraiti üçün nəzərdə tutulmuşdur və 100% sulu sistemə dözə bilir.C18AQ sütunları üzvi turşular, peptidlər, nukleozidlər və suda həll olunan vitaminlər daxil olmaqla, güclü qütb birləşmələrinin ayrılması və təmizlənməsində geniş şəkildə tətbiq edilmişdir.
Duzsuzlaşdırma nümunələr üçün flaş təmizləmədə C18AQ sütunlarının tipik tətbiqlərindən biridir ki, bu da nümunənin sonrakı tədqiqatlarda tətbiqini asanlaşdırmaq üçün nümunə həlledicidəki duz və ya tampon komponentlərini çıxarır.Bu yazıda güclü polariteli Brilliant Blue FCF nümunə kimi istifadə edilib və C18AQ sütununda təmizlənib.Nümunə həlledici bufer məhlulundan üzvi həlledici ilə əvəz olundu, beləliklə, aşağıdakı fırlanan buxarlanma asanlaşdırıldı, həmçinin həlledicilərə və iş vaxtına qənaət edildi.Bundan əlavə, nümunədəki bəzi çirkləri çıxarmaqla nümunənin saflığı yaxşılaşdırıldı.
Eksperimental bölmə
Şəkil 2. Nümunənin kimyəvi quruluşu.
Bu yazıda nümunə kimi Brilliant Blue FCF istifadə edilmişdir.Xam nümunənin təmizliyi 86% təşkil edib və nümunənin kimyəvi strukturu Şəkil 2-də göstərilib. Nümunə məhlulunu hazırlamaq üçün 300 mq Brilliant Blue FCF toz halında xam bərk maddə 1 M NaH2PO4 bufer məhlulunda həll edilib və yaxşıca çalxalanıb. tamamilə aydın bir həll.Nümunə məhlulu daha sonra enjektor vasitəsilə flaş sütuna vuruldu.Fleş təmizləyicinin eksperimental quruluşu Cədvəl 1-də verilmişdir.
| Alət | SepaBean™ Maşın2 | |||
| Patronlar | 12 q SepaFlash C18 RP flaş kartric (sferik silisium, 20 - 45 μm, 100 Å, Sifariş nömrəsi: SW-5222-012-SP) | 12 q SepaFlash C18AQ RP fleş kartric (sferik silisium, 20 - 45 μm, 100 Å, Sifariş nömrəsi: SW-5222-012-SP(AQ))) | ||
| Dalğa uzunluğu | 254 nm | |||
| Mobil mərhələ | Həlledici A: Su Həlledici B: Metanol | |||
| Axın | 30 ml/dəq | |||
| Nümunə yüklənməsi | 300 mq (86% təmizlik ilə Brilliant Blue FCF) | |||
| Qradient | Vaxt (CV) | Həlledici B (%) | Vaxt (CV) | Həlledici B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Nəticələr və Müzakirə
Nümunənin duzsuzlaşdırılması və təmizlənməsi üçün SepaFlash C18AQ RP flaş kartricindən istifadə edilmişdir.Elüsyonun başlanğıcında təmiz suyun mobil faza kimi istifadə edildiyi və 10 sütun həcmi (CV) üçün işləndiyi addım gradientindən istifadə edilmişdir.Şəkil 3-də göstərildiyi kimi, təmiz sudan mobil faza kimi istifadə edildikdə, nümunə tam olaraq flaş kartuşda saxlanıldı.Sonra, mobil fazada metanol birbaşa 100%-ə qədər artırıldı və gradient 7,5 CV üçün saxlanıldı.Nümunə 11,5-dən 13,5 CV-ə qədər elüsiya edildi.Toplanmış fraksiyalarda nümunə məhlulu NaH2PO4 tampon məhlulundan metanolla əvəz edilmişdir.Yüksək sulu məhlul ilə müqayisədə, metanolun sonrakı mərhələdə fırlanan buxarlanma yolu ilə çıxarılması daha asan idi ki, bu da aşağıdakı tədqiqatı asanlaşdırır.
Şəkil 3. C18AQ kartricindəki nümunənin flaş xromatoqramı.
Güclü polarite nümunələri üçün C18AQ kartuşunun və adi C18 kartuşunun saxlama davranışını müqayisə etmək üçün paralel müqayisə testi aparıldı.SepaFlash C18 RP flaş kartricdən istifadə edilib və nümunə üçün flaş xromatoqramı Şəkil 4-də göstərilib. Adi C18 kartricləri üçün ən yüksək dözümlü sulu faza nisbəti təxminən 90% təşkil edir.Buna görə başlanğıc qradiyenti 90% suda 10% metanol olaraq təyin edildi.Şəkil 4-də göstərildiyi kimi, yüksək sulu nisbətin səbəb olduğu C18 zəncirlərinin hidrofobik fazasının çökməsi səbəbindən nümunə adi C18 kartuşunda çətinliklə saxlanıldı və birbaşa mobil faza ilə çıxarıldı.Nəticədə nümunənin duzsuzlaşdırılması və ya təmizlənməsi əməliyyatı tamamlana bilməz.
Şəkil 4. Adi C18 patronda nümunənin flaş xromatoqramı.
Xətti gradientlə müqayisədə addım gradientinin istifadəsi aşağıdakı üstünlüklərə malikdir:
1. Solventdən istifadə və nümunənin təmizlənməsi üçün işləmə müddəti azalır.
2. Hədəf məhsul kəskin zirvədə süzülür ki, bu da yığılan fraksiyaların həcmini azaldır və beləliklə, vaxta qənaət etməklə yanaşı, növbəti dönmə buxarlanmasını asanlaşdırır.
3. Yığılan məhsul metanoldadır və buxarlanmaq asandır, beləliklə qurutma müddəti azalır.
Yekun olaraq, güclü qütblü və ya yüksək hidrofilik olan nümunənin təmizlənməsi üçün SepaBean™ Machine preparativ flaş xromatoqrafiya sistemi ilə birləşən SepaFlash C18AQ RP flaş kartricləri sürətli və səmərəli həll təklif edə bilər.
SepaFlash Bonded Series C18 RP flaş kartricləri haqqında
Santai Texnologiyasından fərqli spesifikasiyalara malik SepaFlash C18AQ RP fleş kartricləri seriyası mövcuddur (Cədvəl 2-də göstərildiyi kimi).
| Maddə nömrəsi | Sütun Ölçüsü | Axın (ml/dəq) | Maks.Təzyiq (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 q | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 q | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 q | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 q | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 q | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 q | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 q | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 q | 40-80 | 250/17.2 |
Cədvəl 2. SepaFlash C18AQ RP fleş kartricləri.
Qablaşdırma materialları: Yüksək effektiv sferik C18(AQ) ilə bağlanmış silisium, 20 - 45 μm, 100 Å.
logiya (cədvəl 2-də göstərildiyi kimi).
Göndərmə vaxtı: 27 avqust 2018-ci il