Hongcheng wang, bo xu
Tətbiq R & D Mərkəzi
Giriş
Stasionar faza və mobil fazanın qüsurlu qütblərinə görə, maye xromatoqrafiya normal faza xromatoqrafiyasına (NPC) və tərs faza xromatogramı (RPC) bölmək olar. RPC üçün, mobil fazanın qütbü stasionar mərhələdən daha güclüdür. RPC, yüksək səmərəliliyi, yaxşı qətnamə və aydın tutma mexanizmi səbəbindən maye xromatoqrafiya ayrılması rejimlərində ən çox istifadə olunan birinə çevrildi. Buna görə RPC müxtəlif qütb və ya qütblü birləşmələrin ayrılması və təmizlənməsi üçün uyğundur, o cümlədən alkaloidlər, karbohidratlar, yağ turşuları, steroidlər, peptidlər, zülallar və s. Cyano, Amino və s. Bu bağlanmış funksional qruplar arasında ən çox istifadə olunan biri C18-dir. RPC-nin 80% -dən çoxunun artıq C18 bağlı mərhələdən istifadə etdiyi təxmin edilir. Buna görə C18 xromatoqrafiya sütunu hər bir laboratoriya üçün universal sütun olmuşdur.
C18 sütunu çox geniş tətbiqlərdə istifadə edilə bilsə də, çox qütb və ya yüksək hidrofilik olan bəzi nümunələr üçün müntəzəm C18 sütunları bu nümunələri təmizləmək üçün istifadə edildikdə problemlər ola bilər. RPC-də, ümumiyyətlə istifadə olunan işlənmiş işlənmiş həlledicilərin qütblərinə görə sifariş edilə bilər: su <metanol <asetonitril <etanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Bu nümunələr üçün sütun (güclü qütb və ya yüksək hidrofilik), sulu sistemin yüksək nisbətinin yüksək nisbətinin yüksək nisbətinin mobil fazası kimi istifadə edilməsi zəruridir. Bununla birlikdə, saf su sistemindən (təmiz su və ya təmiz su və ya təmiz duz həlli də daxil olduqda), C18 sütununun stasionar mərhələsindəki uzun karbon zənciri suyun qarşısını almağa və bir-birinizlə qarışdırmağı və ya hətta tutma qabiliyyətinin ani azalmasına səbəb olur. Bu fenomenə "hidrofob faza çökməsi" adlanır (Şəkil 1-in sol hissəsində göstərildiyi kimi). Bu vəziyyət, sütun metanol və ya asetonitril kimi üzvi həlledicilərlə yuyulduqda, yenə də sütuna ziyan vura bilər. Buna görə də bu vəziyyətin baş verməsinin qarşısını almaq lazımdır.
Şəkil 1. Müntəzəm C18 sütun (solda) və C18AQ sütundakı silikon gel səthindəki bağlanmış mərhələlərin sxematik diaqramı.
Yuxarıda göstərilən problemləri həll etmək üçün xromatoqrafik qablaşdırma materialları istehsalçıları texniki inkişaflar etdilər. Bu yaxşılaşdırmalardan biri, silikofilik CYANO qruplarının (1-in sağ hissəsində göstərildiyi kimi göstərildiyi kimi silikon matrisinin səthində bəzi dəyişikliklər edilir, silikon gelinin səthini daha çox hidrofilik etmək. Beləliklə, silisium səthindəki C18 zəncirləri yüksək sulu şəraitdə tam uzadıla bilər və hidrofob faza çökmək olar. Bu dəyişdirilmiş C18 sütunları sulu C18 sütunları adlanır, yəni yüksək sulu şanslı şərtlər üçün hazırlanmış və 100% sulu sistemə dözə bilən C18AQ sütunları adlanır. C18AQ sütunları, üzvi turşular, peptidlər, nukleozidlər və suda həll olunan vitaminlər də daxil olmaqla güclü qütb birləşmələrinin ayrılması və təmizlənməsi zamanı geniş tətbiq edilmişdir.
Disalting, sonrakı araşdırmalarda nümunə həlledicisində duz və ya tampon komponentlərini təmizləyən nümunələrin saflaşdırılmasında olan C18AQ sütunlarının tipik tətbiqlərindən biridir. Bu yazıda, güclü polarite olan parlaq mavi FCF, nümunə və C18AQ sütununda təmizlənmiş kimi istifadə edilmişdir. Nümunə həlledicisi, bufer həllindən üzvi həlledici ilə əvəz olundu, beləliklə aşağıdakı fırlanan buxarlanmanı asanlaşdıran, həm də həlledicilərə və əməliyyat vaxtını xilas edir. Bundan əlavə, nümunənin saflığı, nümunədə bəzi çirkləri aradan qaldırmaqla yaxşılaşdırıldı.
Eksperimental bölmə
Şəkil 2. Nümunənin kimyəvi quruluşu.
Parlaq mavi FCF bu yazıda nümunə olaraq istifadə edilmişdir. Xam nümunəsinin saflığı 86%, nümunənin kimyəvi quruluşu Şəkil 2-də göstərilmişdir. Nümunə məhlulu daha sonra bir injektor tərəfindən flash sütunununa enjekte edildi. Flash təmizliyinin eksperimental quruluşu cədvəl 1-də verilmişdir.
| Alət | Sepabean ™ maşını2 | |||
| Patron | 12 G Sepaflash C18 RP Flash patron (sferik silisium, 20 - 45 mkm, 100 μ, sifariş nömrəsi: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP Flash patron (sferik silisium, 20 - 45 mkm, 100 μ, sifariş nömrəsi: SW-5222-012-SP (AQ))) | ||
| Dalğa uzunluğu | 254 nm | |||
| Mobil faza | Solvent A: Su Solvent B: Metanol | |||
| Axın | 30 ml / dəq | |||
| Nümunə yükləmə | 300 mq (86% təmizliyi olan parlaq mavi fcf) | |||
| Gradient | Zaman (CV) | Solvent b (%) | Zaman (CV) | Solvent b (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Nəticələr və müzakirə
Bir Sepaflash C18AQ RP Flash patronu, nümunə və təmizlənmə üçün istifadə edildi. Addım Gradient, təmiz suyun işlənib başlanğıcında mobil faza kimi istifadə olunduğu və 10 sütun həcmi (CV) işlədilmiş istifadə edildi. Şəkil 3-də göstərildiyi kimi, saf suyu mobil faza kimi istifadə edərkən nümunə flash patronda tamamilə saxlanıldı. Sonrakı, mobil fazadakı metanol birbaşa 100% -ə yüksəldi və 7.5 CV üçün gradient saxlanıldı. Nümunə 11,5 - 13,5 CV-dən təmizləndi. Toplanmış fraksiyalarda nümunə həlli Nah2po4 bufer məhlulundan metanola dəyişdirildi. Yüksək sulu bir həll ilə müqayisə edərək, metanol sonrakı tədqiqatı asanlaşdıran sonrakı addımda fırlanan buxarlanma ilə çıxarılmasını asanlaşdırdı.
Şəkil 3. Nümunənin flaş xromatogramı bir C18AQ patronunda.
Güclü polarite nümunələri üçün C18AQ kartuşu və müntəzəm C18 patronunun saxlanma davranışını müqayisə etmək, paralel müqayisə testi edildi. Sepaflash C18 RP flash patron istifadə edildi və nümunə üçün flash xromatoqram Şəkil 4-də göstərildi. Daimi C18 patronları üçün ən yüksək dözümlü sulu faza nisbəti 90% -dir. Buna görə başlanğıc gradient 90% suda 10% metanol qoyuldu. Şəkil 4-də göstərildiyi kimi, yüksək sulu nisbətdən qaynaqlanan C18 zəncirlərinin hidrofobik fazası çökməsi səbəbindən nümunə mütəmadi C18 patronunda çətinliklə saxlanıldı və mobil faza tərəfindən birbaşa işləndi. Nəticədə nümunə diyirlənən və ya təmizlənmə əməliyyatı başa çatdırıla bilməz.
Şəkil 4. Nümunənin flaş xromatogramı müntəzəm C18 patronunda.
Xətti gradient ilə müqayisə edərək, addım-addım istifadə aşağıdakı üstünlüklərə malikdir:
1. Solvent istifadəsi və nümunə təmizlənməsi üçün vaxt azalır.
2. Hədəf məhsulu, toplanmış fraksiyaların həcmini azaldan və beləliklə aşağıdakı fırlanan buxarlanmanı asanlaşdıran kəskin zirvədə işləyir.
3. Toplanmış məhsul buxarlanmağın asan olduğu metanoldadır, beləliklə qurutma vaxtı azalır.
Sonda, güclü qütblü və ya yüksək hidrofilik olan nümunənin təmizlənməsi üçün, Sepaflash C18AQ RP-nin hazırlanan flash xromatoqrafiya sistemi Sepabean ™ maşını ilə birləşən flash patronlar sürətli və səmərəli bir həll təklif edə bilər.
Sepaflash bağlı Seriya C18 RP Flash patronları haqqında
Sepaflash C18AQ RP flash patronları Santai texnologiyasından fərqli xüsusiyyətləri (Cədvəl 2-də göstərildiyi kimi) bir sıra var.
| Maddə nömrəsi | Sütun ölçüsü | Axın (ml / dəq) | Max.Pressure (Psi / bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350 / 24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/12.2 |
Cədvəl 2. Sepaflash C18AQ RP Flash patronları.
Qablaşdırma materialları: Yüksək səmərəli sferik C18 (AQ) -Honded silisium, 20 - 45 mkm, 100 å.
logy (Cədvəl 2-də göstərildiyi kimi).
Time vaxt: avqust-27-2018