هونغتشنغ وانغ ، بو شو
مركز البحث والتطوير التطبيقي
مقدمة
وفقًا للاستقطاب النسبي للطور الثابت والطور المتحرك ، يمكن تقسيم الكروماتوغرافيا السائلة إلى كروماتوغرافيا الطور العادي (NPC) وكروماتوغرافيا الطور العكسي (RPC).بالنسبة إلى RPC ، تكون قطبية الطور المتحرك أقوى من قطبية الطور الثابت.أصبح RPC هو الأكثر استخدامًا في أوضاع الفصل الكروماتوجرافي السائل نظرًا لكفاءته العالية ودقة الوضوح الجيدة وآلية الاحتفاظ الواضحة.لذلك فإن RPC مناسب لفصل وتنقية المركبات القطبية وغير القطبية المختلفة ، بما في ذلك القلويات والكربوهيدرات والأحماض الدهنية والمنشطات والأحماض النووية والأحماض الأمينية والببتيدات والبروتينات وما إلى ذلك. في RPC ، المرحلة الثابتة الأكثر شيوعًا هي مصفوفة هلام السيليكا المرتبطة بمجموعات وظيفية مختلفة ، بما في ذلك C18 ، C8 ، C4 ، فينيل ، سيانو ، أمينو ، إلخ. من بين هذه المجموعات الوظيفية المترابطة ، أكثرها استخدامًا هو C18.تشير التقديرات إلى أن أكثر من 80٪ من RPC تستخدم الآن المرحلة الرابطة C18.لذلك أصبح عمود الكروماتوغرافيا C18 عمودًا عالميًا ضروريًا لكل مختبر.
على الرغم من أنه يمكن استخدام عمود C18 في مجموعة واسعة جدًا من التطبيقات ، إلا أنه بالنسبة لبعض العينات التي تكون شديدة القطبية أو عالية الماء ، قد تواجه أعمدة C18 العادية مشاكل عند استخدامها لتنقية مثل هذه العينات.في RPC ، يمكن طلب مذيبات الشطف شائعة الاستخدام وفقًا لقطبيتها: ماء <ميثانول <أسيتونيتريل <إيثانول <تتراهيدروفوران <أيزوبروبانول.لضمان الاحتفاظ الجيد في العمود لهذه العينات (قطبية قوية أو عالية الماء) ، من الضروري استخدام نسبة عالية من النظام المائي كمرحلة متحركة.ومع ذلك ، عند استخدام نظام الماء النقي (بما في ذلك الماء النقي أو محلول الملح النقي) كمرحلة متحركة ، تميل سلسلة الكربون الطويلة في المرحلة الثابتة لعمود C18 إلى تجنب الماء والخلط مع بعضها البعض ، مما يؤدي إلى انخفاض فوري في قدرة الاستبقاء للعمود أو حتى عدم الاحتفاظ به.تسمى هذه الظاهرة "انهيار طور كاره للماء" (كما هو موضح في الجزء الأيسر من الشكل 1).على الرغم من أن هذا الموقف قابل للعكس عند غسل العمود بالمذيبات العضوية مثل الميثانول أو الأسيتونتريل ، إلا أنه لا يزال من الممكن أن يتسبب في تلف العمود.لذلك ، من الضروري منع حدوث هذا الموقف.
الشكل 1. الرسم التخطيطي لمراحل الترابط على سطح هلام السيليكا في عمود C18 العادي (يسار) وعمود C18AQ (يمين).
لمعالجة المشاكل المذكورة أعلاه ، قام مصنعو مواد التغليف الكروماتوغرافي بإجراء تحسينات تقنية.يتمثل أحد هذه التحسينات في إجراء بعض التعديلات على سطح مصفوفة السيليكا ، مثل إدخال مجموعات cyano المحبة للماء (كما هو موضح في الجزء الأيمن من الشكل 1) ، لجعل سطح هلام السيليكا أكثر محبة للماء.وبالتالي يمكن تمديد سلاسل C18 الموجودة على سطح السيليكا بشكل كامل في ظل ظروف مائية عالية ويمكن تجنب انهيار المرحلة الكارهة للماء.تسمى أعمدة C18 المعدلة هذه الأعمدة المائية C18 ، وهي أعمدة C18AQ ، والتي تم تصميمها لظروف الشطف المائي للغاية ويمكن أن تتحمل نظامًا مائيًا بنسبة 100٪.تم تطبيق أعمدة C18AQ على نطاق واسع في فصل وتنقية المركبات القطبية القوية ، بما في ذلك الأحماض العضوية والببتيدات والنيوكليوسيدات والفيتامينات القابلة للذوبان في الماء.
تعد إزالة الملوحة أحد التطبيقات النموذجية لأعمدة C18AQ في تنقية العينات ، والتي تزيل الملح أو مكونات العازلة في عينة المذيب لتسهيل تطبيق العينة في الدراسات اللاحقة.في هذا المنشور ، تم استخدام Brilliant Blue FCF مع قطبية قوية كعينة وتنقيتها في عمود C18AQ.تم استبدال مذيب العينة بمذيب عضوي من محلول منظم ، وبالتالي تسهيل التبخر الدوراني التالي بالإضافة إلى توفير المذيبات ووقت التشغيل.علاوة على ذلك ، تم تحسين نقاء العينة عن طريق إزالة بعض الشوائب من العينة.
القسم التجريبي
الشكل 2. التركيب الكيميائي للعينة.
تم استخدام Brilliant Blue FCF كعينة في هذا المنشور.كانت درجة نقاء العينة الخام 86٪ وتم عرض التركيب الكيميائي للعينة في الشكل 2. لتحضير محلول العينة ، تم إذابة 300 مجم من مسحوق المواد الصلبة الخام من Brilliant Blue FCF في محلول منظم 1 M NaH2PO4 واهتز جيدًا ليصبح حل واضح تماما.ثم تم حقن محلول العينة في عمود الوميض بواسطة حاقن.يتم سرد الإعداد التجريبي لتنقية الفلاش في الجدول 1.
| أداة | آلة SepaBean ™2 | |||
| خراطيش | خرطوشة فلاش SepaFlash C18 RP سعة 12 جم (سيليكا كروية ، 20-45 ميكرومتر ، 100 أوم ، رقم الطلب: SW-5222-012-SP) | خرطوشة فلاش SepaFlash C18AQ RP سعة 12 جم (سيليكا كروية ، 20-45 ميكرومتر ، 100 أوم ، رقم الطلب ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| الطول الموجي | 254 نانومتر | |||
| المرحلة المتنقلة | المذيب أ： الماء المذيب ب ： الميثانول | |||
| معدل المد و الجزر | 30 مل / دقيقة | |||
| تحميل العينة | 300 مجم (أزرق لامع FCF بنقاوة 86٪) | |||
| الانحدار | الوقت (السيرة الذاتية) | المذيب ب (٪) | الوقت (السيرة الذاتية) | المذيب ب (٪) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
النتائج والمناقشة
تم استخدام خرطوشة فلاش SepaFlash C18AQ RP لتحلية العينات وتنقيتها.تم استخدام التدرج التدريجي الذي تم فيه استخدام الماء النقي كمرحلة متحركة في بداية الشطف وتشغيل 10 أحجام أعمدة (CV).كما هو مبين في الشكل 3 ، عند استخدام الماء النقي كمرحلة متنقلة ، يتم الاحتفاظ بالعينة تمامًا على خرطوشة الفلاش.بعد ذلك ، تمت زيادة الميثانول في الطور المتحرك بشكل مباشر إلى 100٪ وتم الحفاظ على التدرج لـ 7.5 CV.تم استخلاص العينة من 11.5 إلى 13.5 CV.في الكسور التي تم جمعها ، تم استبدال محلول العينة من محلول المخزن المؤقت NaH2PO4 إلى الميثانول.بالمقارنة مع المحلول المائي للغاية ، كان من الأسهل بكثير إزالة الميثانول عن طريق التبخر الدوراني في الخطوة التالية ، مما يسهل البحث التالي.
الشكل 3. كروماتوجرام الفلاش للعينة على خرطوشة C18AQ.
لمقارنة سلوك الاحتفاظ لخرطوشة C18AQ وخرطوشة C18 العادية لعينات ذات قطبية قوية ، تم إجراء اختبار مقارنة موازية.تم استخدام خرطوشة فلاش SepaFlash C18 RP وتم عرض كروماتوجرام الفلاش للعينة في الشكل 4. بالنسبة لخراطيش C18 العادية ، تبلغ أعلى نسبة طور مائي تحملها حوالي 90٪.لذلك تم ضبط تدرج البداية عند 10٪ ميثانول في 90٪ ماء.كما هو مبين في الشكل 4 ، نظرًا لانهيار المرحلة الكارهة للماء لسلاسل C18 الناجم عن ارتفاع نسبة الماء ، تم الاحتفاظ بالعينة بالكاد على خرطوشة C18 العادية وتم التخلص منها مباشرة بواسطة المرحلة المتنقلة.نتيجة لذلك ، لا يمكن إتمام عملية تحلية أو تنقية العينات.
الشكل 4. كروماتوجرام فلاش للعينة على خرطوشة C18 عادية.
بالمقارنة مع التدرج الخطي ، فإن استخدام التدرج اللوني له المزايا التالية:
1. تم تقليل استخدام المذيبات ووقت التشغيل لتنقية العينة.
2. يزيل المنتج المستهدف قمة حادة ، مما يقلل من حجم الكسور المجمعة وبالتالي يسهل التبخر الدوراني التالي بالإضافة إلى توفير الوقت.
3. المنتج الذي تم تجميعه موجود في الميثانول الذي يسهل تبخيره ، وبالتالي يتم تقليل وقت التجفيف.
في الختام ، من أجل تنقية العينة القطبية بشدة أو عالية الماء ، يمكن أن تقدم خراطيش فلاش SepaFlash C18AQ RP مع نظام كروماتوغرافيا الفلاش التحضيري SepaBean ™ Machine حلاً سريعًا وفعالًا.
حول خراطيش فلاش SepaFlash Bonded Series C18 RP
توجد سلسلة من خراطيش فلاش SepaFlash C18AQ RP بمواصفات مختلفة من Santai Technology (كما هو موضح في الجدول 2).
| رقم الشيء | حجم العمود | معدل المد و الجزر (مل / دقيقة) | أقصى ضغط (رطل / بار) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 جرام | 5-15 | 400 / 27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 جرام | 10-25 | 400 / 27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 جرام | 10-25 | 400 / 27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 جرام | 15-30 | 400 / 27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 جرام | 25-50 | 350 / 24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 جرام | 30-60 | 300 / 20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 غرام | 40-80 | 300 / 20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 جرام | 40-80 | 250 / 17.2 |
الجدول 2. خراطيش فلاش SepaFlash C18AQ RP.
مواد التعبئة والتغليف: سيليكا كروية عالية الكفاءة C18 (AQ) ، 20-45 ميكرومتر ، 100.
logy (كما هو موضح في الجدول 2).
الوقت ما بعد: 27 أغسطس 2018