Rui Huang, Bo Xu
Aansoek R&D Sentrum
Inleiding
'n Peptied is 'n verbinding wat bestaan uit aminosure, wat elkeen unieke fisiese en chemiese eienskappe het as gevolg van die verskillende tipes en volgorde van aminosuurreste wat die volgorde daarvan uitmaak.Met die ontwikkeling van vastefase chemiese sintese het die chemiese sintese van verskeie aktiewe peptiede groot vordering gemaak.As gevolg van die ingewikkelde samestelling van die peptied wat deur vastefasesintese verkry word, moet die finale produk egter deur betroubare skeidingsmetodes gesuiwer word.Die algemeen gebruikte suiweringsmetodes vir peptiede sluit in ioonuitruilchromatografie (IEC) en omgekeerde-fase hoë werkverrigting vloeistofchromatografie (RP-HPLC), wat die nadele het van lae monsterlaaikapasiteit, hoë koste van skeidingsmedia, ingewikkelde en duur skeidingstoerusting, ens. Vir die vinnige suiwering van klein molekule peptiede (MW < 1 kDa), is 'n suksesvolle toepassingsgeval voorheen deur Santai Technologies gepubliseer, waarin 'n SepaFlash RP C18 patroon gebruik is vir die vinnige suiwering van timopentien (TP-5) en die teikenproduk wat aan die vereistes voldoen is verkry.
Figuur 1. 20 algemene aminosure (weergegee vanaf www.bachem.com).
Daar is 20 soorte aminosure wat algemeen in die samestelling van peptiede voorkom.Hierdie aminosure kan volgens hul polariteit en suur-basis-eienskap in die volgende groepe verdeel word: nie-polêr (hidrofobies), polêr (ongelaaid), suur of basies (soos getoon in Figuur 1).In 'n peptiedvolgorde, as die aminosure wat die volgorde uitmaak meestal polêres is (soos gemerk in pienk kleur in Figuur 1), soos Cysteine, Glutamine, Asparagine, Serine, Threonine, Tyrosien, ens., dan kan hierdie peptied 'n sterk polariteit en hoogs oplosbaar in water wees.Tydens die suiweringsprosedure vir hierdie sterk polêre peptiedmonsters deur omgekeerde-fase-chromatografie, sal 'n verskynsel genaamd hidrofobiese fase-ineenstorting voorkom (verwys na 'n voorheen gepubliseerde aansoeknota deur Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).In vergelyking met die gewone C18-kolomme, is die verbeterde C18AQ-kolomme die mees geskikte vir die suiwering van sterk polêre of hidrofiliese monsters.In hierdie pos is 'n sterk polêre peptied as die monster gebruik en gesuiwer deur 'n C18AQ kolom.Gevolglik is die teikenproduk wat aan die vereistes voldoen, verkry en kon dit in die volgende navorsing en ontwikkeling gebruik word.
| Instrument | SepaBean™masjien 2 | |||
| Patrone | 12 g SepaFlash C18 RP-flitspatroon (sferiese silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestelnommer:SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP-flitspatroon (sferiese silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestelnommer:SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Golflengte | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobiele fase | Oplosmiddel A: Water Oplosmiddel B: Asetonitril | |||
| Vloeitempo | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Monster laai | 30 mg | |||
| Gradiënt | Tyd (CV) | Oplosmiddel B (%) | Tyd (min) | Oplosmiddel B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13,0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14,0 | 22 | |
| 19,0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18,0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Resultate en bespreking
Om die suiweringsprestasie vir die polêre peptiedmonster tussen gewone C18-kolom en C18AQ-kolom te vergelyk, het ons 'n gewone C18-kolom gebruik vir die blitssuiwering van die monster as 'n begin.Soos getoon in Figuur 2, as gevolg van die hidrofobiese fase ineenstorting van die C18 kettings wat veroorsaak word deur 'n hoë waterige verhouding, is die monster skaars behou op die gewone C18 patroon en is direk uitgeelueer deur die mobiele fase.As gevolg hiervan is die monster nie effektief geskei en gesuiwer nie.
Figuur 2. Die flitschromatogram van die monster op 'n gewone C18-patroon.
Vervolgens het ons 'n C18AQ-kolom gebruik vir die blitssuiwering van die monster.Soos getoon in Figuur 3, is die peptied effektief op die kolom behou en dan uitgeelueer.Die teikenproduk is van die onsuiwerhede in die rou monster geskei en versamel.Na lyofilisering en dan deur HPLC ontleed, het die gesuiwerde produk 'n suiwerheid van 98.2% en kan verder aangewend word vir volgende stap navorsing en ontwikkeling.
Figuur 3. Die flitschromatogram van die monster op 'n C18AQ-patroon.
Ten slotte, SepaFlash C18AQ RP flitspatroon gekombineer met die flitschromatografiestelsel SepaBean™masjien kan 'n vinnige en effektiewe oplossing bied vir die suiwering van sterk polêre of hidrofiliese monsters.
Daar is 'n reeks van die SepaFlash C18AQ RP-flitspatrone met verskillende spesifikasies van Santai Tegnologie (soos in Tabel 2 getoon).
| Item nommer | Kolomgrootte | Vloeitempo (ml/min) | Maks.druk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabel 2. SepaFlash C18AQ RP flitspatrone.Verpakkingsmateriaal: Hoë-doeltreffendheid sferiese C18(AQ)-gebonde silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
Vir verdere inligting oor gedetailleerde spesifikasies van SepaBean™-masjien, of die bestelinligting oor SepaFlash-reeks flitspatrone, besoek asseblief ons webwerf.
Plaas tyd: Okt-12-2018