Hongcheng Wang, Bo Xu
Aansoek R&D Sentrum
Inleiding
Volgens die relatiewe polariteite van stilstaande fase en mobiele fase, kan vloeistofchromatografie verdeel word in normale fase chromatografie (NPC) en omgekeerde fase chromatografie (RPC).Vir RPC is die polariteit van die mobiele fase sterker as dié van die stilstaande fase.RPC het die mees gebruikte een in vloeistofchromatografie-skeidingsmodusse geword as gevolg van sy hoë doeltreffendheid, goeie resolusie en duidelike retensiemeganisme.Daarom is RPC geskik vir die skeiding en suiwering van verskeie polêre of nie-polêre verbindings, insluitend alkaloïede, koolhidrate, vetsure, steroïede, nukleïensure, aminosure, peptiede, proteïene, ens. In RPC is die stilstaande fase die algemeenste gebruik word. die silikagelmatriks wat met verskeie funksionele groepe gebind is, insluitend C18, C8, C4, feniel, siano, amino, ens. Onder hierdie gebonde funksionele groepe is die mees gebruikte een C18.Daar word beraam dat meer as 80% van RPC nou C18-gebonde fase gebruik.Daarom het C18-chromatografiekolom 'n moet-hê universele kolom vir elke laboratorium geword.
Alhoewel C18-kolom in 'n baie wye reeks toepassings gebruik kan word, kan gereelde C18-kolomme egter vir sommige monsters wat baie polêr of hoogs hidrofiel is, probleme hê wanneer dit gebruik word om sulke monsters te suiwer.In RPC kan die algemeen gebruikte elueringsoplosmiddels volgens hul polariteit bestel word: water < metanol < asetonitrile < etanol < tetrahidrofuraan < isopropanol.Om goeie retensie op die kolom vir hierdie monsters (sterk polêr of hoogs hidrofilies) te verseker, is 'n hoë proporsie waterige sisteem nodig om as die mobiele fase gebruik te word.Wanneer egter suiwer waterstelsel (insluitend suiwer water of suiwer soutoplossing) as die mobiele fase gebruik word, is die lang koolstofketting op die stilstaande fase van C18-kolom geneig om die water te vermy en met mekaar te meng, wat lei tot 'n oombliklike afname in die retensievermoë van die kolom of selfs geen retensie nie.Hierdie verskynsel word "hidrofobiese fase-ineenstorting" genoem (soos in die linkerdeel van Figuur 1 getoon).Alhoewel hierdie situasie omkeerbaar is wanneer die kolom met organiese oplosmiddels soos metanol of asetonitriel gewas word, kan dit steeds skade aan die kolom veroorsaak.Daarom is dit nodig om te verhoed dat hierdie situasie gebeur.
Figuur 1. Die skematiese diagram van die gebonde fases op die oppervlak van silikagel in gewone C18-kolom (links) en C18AQ-kolom (regs).
Om bogenoemde probleme aan te spreek, het die vervaardigers van chromatografiese verpakkingsmateriaal tegniese verbeterings aangebring.Een van hierdie verbeterings is om 'n paar veranderinge aan die oppervlak van die silika-matriks te maak, soos die bekendstelling van hidrofiele sianogroepe (soos in die regterkant van Figuur 1 getoon), om die oppervlak van die silikagel meer hidrofiel te maak.Die C18-kettings op die silika-oppervlak kon dus ten volle verleng word onder hoogs waterige toestande en die hidrofobiese fase-ineenstorting kon vermy word.Hierdie gewysigde C18-kolomme word waterige C18-kolomme genoem, naamlik C18AQ-kolomme, wat ontwerp is vir hoogs waterige elueringstoestande en 100% waterige sisteem kan verdra.C18AQ-kolomme is wyd toegepas in die skeiding en suiwering van sterk polêre verbindings, insluitend organiese sure, peptiede, nukleosiede en wateroplosbare vitamiene.
Ontsouting is een van die tipiese toepassings van C18AQ-kolomme in die flitssuiwering vir monsters, wat die sout- of bufferkomponente in die monsteroplosmiddel verwyder om die toediening van die monster in daaropvolgende studies te vergemaklik.In hierdie pos is die Brilliant Blue FCF met sterk polariteit as die monster gebruik en op die C18AQ kolom gesuiwer.Die monsteroplosmiddel is vervang deur organiese oplosmiddel uit bufferoplossing, wat sodoende die volgende rotasie-verdamping vergemaklik asook om oplosmiddels en bedryfstyd te bespaar.Verder is die suiwerheid van die monster verbeter deur sommige onsuiwerhede in die monster te verwyder.
eksperimentele afdeling
Figuur 2. Die chemiese struktuur van die monster.
Die Brilliant Blue FCF is as voorbeeld in hierdie pos gebruik.Die suiwerheid van die rou monster was 86% en die chemiese struktuur van die monster is in Figuur 2 getoon. Om die monsteroplossing voor te berei, is 300 mg poeieragtige ru vaste stof van Brilliant Blue FCF in 1 M NaH2PO4 bufferoplossing opgelos en goed geskud om dit te word 'n heeltemal duidelike oplossing.Die monsteroplossing is dan deur 'n inspuiter in die flitskolom ingespuit.Die eksperimentele opstelling van die flitssuiwering word in Tabel 1 gelys.
| Instrument | SepaBean™-masjien2 | |||
| Patrone | 12 g SepaFlash C18 RP-flitspatroon (sferiese silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestelnommer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP-flitspatroon (sferiese silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestelnommer:SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Golflengte | 254 nm | |||
| Mobiele fase | Oplosmiddel A: Water Oplosmiddel B: Metanol | |||
| Vloeitempo | 30 ml/min | |||
| Monster laai | 300 mg (Brilliant Blue FCF met die suiwerheid van 86%) | |||
| Gradiënt | Tyd (CV) | Oplosmiddel B (%) | Tyd (CV) | Oplosmiddel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultate en bespreking
'n SepaFlash C18AQ RP flitspatroon is gebruik vir monsterontsouting en suiwering.Stapgradiënt is gebruik waarin suiwer water as die mobiele fase aan die begin van eluering gebruik is en vir 10 kolomvolumes (CV) uitgevoer is.Soos getoon in Figuur 3, wanneer suiwer water as die mobiele fase gebruik word, is die monster heeltemal op die flitspatroon behou.Vervolgens is die metanol in die mobiele fase direk verhoog na 100% en die gradiënt is gehandhaaf vir 7.5 CV.Die monster is van 11.5 tot 13.5 CV geëlueer.In die versamelde fraksies is die monsteroplossing van NaH2PO4-bufferoplossing na metanol vervang.In vergelyking met hoogs waterige oplossing, was metanol baie makliker om deur roterende verdamping in die daaropvolgende stap verwyder te word, wat die volgende navorsing vergemaklik.
Figuur 3. Die flitschromatogram van die monster op 'n C18AQ-patroon.
Om die retensiegedrag van C18AQ-patroon en gewone C18-patroon vir monsters met sterk polariteit te vergelyk, is parallelle vergelykingstoets uitgevoer.'n SepaFlash C18 RP-flitspatroon is gebruik en die flitschromatogram vir die monster is in Figuur 4 getoon. Vir gewone C18-patrone is die hoogste verdraagsame waterfaseverhouding ongeveer 90%.Daarom is die begingradiënt gestel op 10% metanol in 90% water.Soos getoon in Figuur 4, as gevolg van die hidrofobiese fase ineenstorting van die C18 kettings veroorsaak deur 'n hoë waterige verhouding, is die monster skaars behou op die gewone C18 patroon en is direk uitgeelueer deur die mobiele fase.Gevolglik kan die werking van monsterontsouting of suiwering nie voltooi word nie.
Figuur 4. Die flitschromatogram van die monster op 'n gewone C18-patroon.
In vergelyking met lineêre gradiënt, het die gebruik van stapgradiënt die volgende voordele:
1. Oplosmiddelgebruik en looptyd vir monstersuiwering word verminder.
2. Die teikenproduk elueer in 'n skerp piek, wat die volume van versamelde fraksies verminder en sodoende die volgende roterende verdamping vergemaklik asook tyd bespaar.
3. Die versamelde produk is in metanol wat maklik verdamp kan word, dus word droogtyd verminder.
Ten slotte, vir die suiwering van die monster wat sterk polêr of hoogs hidrofiel is, kan SepaFlash C18AQ RP flitspatrone wat gekombineer word met die voorbereidende flitschromatografiestelsel SepaBean™ Machine 'n vinnige en doeltreffende oplossing bied.
Oor die SepaFlash Bonded Series C18 RP-flitspatrone
Daar is 'n reeks van die SepaFlash C18AQ RP-flitspatrone met verskillende spesifikasies van Santai Tegnologie (soos in Tabel 2 getoon).
| Item nommer | Kolomgrootte | Vloeitempo (ml/min) | Maks.druk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabel 2. SepaFlash C18AQ RP flitspatrone.
Verpakkingsmateriaal: Hoë-doeltreffendheid sferiese C18(AQ)-gebonde silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
logie (soos in Tabel 2 getoon).
Plaas tyd: Aug-27-2018