Hongcheng Wang, Bo Xu
Toepassing R & D -sentrum
Bekendstelling
Volgens die relatiewe polariteite van stilstaande fase en mobiele fase, kan vloeistofchromatografie in normale fase -chromatografie (NPC) en omgekeerde fasechromatografie (RPC) verdeel word. Vir RPC is die polariteit van die mobiele fase sterker as dié van die stilstaande fase. RPC het die mees gebruikte een geword in vloeistofchromatografie -skeidingsmetodes vanweë die hoë doeltreffendheid, goeie resolusie en duidelike retensiemeganisme. Daarom is RPC geskik vir die skeiding en suiwering van verskillende polêre of nie-polêre verbindings, insluitend alkaloïede, koolhidrate, vetsure, steroïede, nukleïensure, aminosure, peptiede, proteïene, ens. In RPC, die mees algemene fase is die Silica Gel-matriks, wat gekoppel is aan verskillende groepe, insluitend C18, C8, C8, Cyano, amino, ens. Onder hierdie gebonde funksionele groepe is die mees gebruikte C18. Daar word beraam dat meer as 80% van die RPC nou C18 -gebonde fase gebruik. Daarom het C18-chromatografiekolom 'n universele kolom vir elke laboratorium geword.
Alhoewel C18 -kolom in 'n baie wye verskeidenheid toepassings gebruik kan word, kan dit egter vir sommige monsters wat baie polêr of hoogs hidrofilies is, probleme hê as dit gebruik word om sulke monsters te suiwer. In RPC kan die algemeen gebruikte elueringsoplosmiddels volgens hul polariteit bestel word: water <metanol <asetonitril <etanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Om goeie behoud op die kolom vir hierdie monsters (sterk pool of hoogs hidrofilies) te verseker, is 'n groot hoeveelheid waterige stelsel nodig om as mobiele fase gebruik te word. By die gebruik van suiwer waterstelsel (insluitend suiwer water of suiwer soutoplossing) as die mobiele fase, is die lang koolstofketting op die stilstaande fase van die C18 -kolom geneig om die water te vermy en met mekaar te meng, wat lei tot 'n onmiddellike afname in die retensiekapasiteit van die kolom of selfs geen retensie nie. Hierdie verskynsel word “hidrofobiese fase -ineenstorting” genoem (soos getoon in die linker deel van Figuur 1). Alhoewel hierdie situasie omkeerbaar is wanneer die kolom met organiese oplosmiddels soos metanol of asetonitril gewas word, kan dit steeds die kolom skade berokken. Daarom is dit nodig om te voorkom dat hierdie situasie plaasvind.
Figuur 1. Die skematiese diagram van die gebonde fases op die oppervlak van silikagel in gewone C18 -kolom (links) en C18AQ -kolom (regs).
Om bogenoemde probleme aan te spreek, het die vervaardigers van chromatografiese verpakkingsmateriaal tegniese verbeterings aangebring. Een van hierdie verbeterings is om enkele modifikasies op die oppervlak van die silika -matriks, soos die bekendstelling van hidrofiliese siano -groepe (soos in die regte deel van Figuur 1) aan te pas om die oppervlak van die silikagel meer hidrofilies te maak. Dus kan die C18 -kettings op die silika -oppervlak onder baie waterige toestande volledig verleng word en die hidrofobiese fase -ineenstorting kan vermy word. Hierdie gewysigde C18 -kolomme word waterige C18 -kolomme genoem, naamlik C18AQ -kolomme, wat ontwerp is vir hoogs waterige elueringstoestande en die 100% waterige stelsel kan verdra. C18AQ-kolomme is wyd toegepas in die skeiding en suiwering van sterk polêre verbindings, insluitend organiese sure, peptiede, nukleosiede en wateroplosbare vitamiene.
Onthef is een van die tipiese toepassings van C18AQ -kolomme in die flitssuiwering vir monsters, wat die sout- of bufferkomponente in die monsteroplosmiddel verwyder om die toepassing van die monster in daaropvolgende studies te vergemaklik. In hierdie pos is die briljante blou FCF met 'n sterk polariteit as monster gebruik en in die C18AQ -kolom gesuiwer. Die monsteroplosmiddel is vervang deur organiese oplosmiddel uit bufferoplossing, wat die volgende verdamping van die draai van die draai en die besparing van oplosmiddels en die werkingstyd vergemaklik. Verder is die suiwerheid van die monster verbeter deur sommige onsuiwerhede in die monster te verwyder.
Eksperimentele afdeling
Figuur 2. Die chemiese struktuur van die monster.
Die briljante blou FCF is in hierdie pos as monster gebruik. Die suiwerheid van die rou monster was 86% en die chemiese struktuur van die monster is in Figuur 2 getoon. Om die monsteroplossing voor te berei, is 300 mg poeieragtige ru -vaste stof van briljante blou FCF opgelos in 1 M NaH2PO4 -bufferoplossing en het goed geskud om 'n duidelike oplossing te word. Die monsteroplossing is daarna deur 'n inspuiter in die flitskolom ingespuit. Die eksperimentele opstelling van die flitssuiwering word in Tabel 1 gelys.
| Instrument | Sepabean ™ -masjien2 | |||
| Cartridges | 12 G Sepaflash C18 RP-flitspatroon (sferiese silika, 20-45 μm, 100 Å, bestelnommer: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP-flitspatroon (sferiese silika, 20-45 μm, 100 Å, bestelnommer ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Golflengte | 254 nm | |||
| Mobiele fase | Oplosmiddel A ： Water Oplosmiddel B ： Metanol | |||
| Vloeitempo | 30 ml/min | |||
| Monster laai | 300 mg (briljante blou FCF met die suiwerheid van 86%) | |||
| Gradiënt | Tyd (CV) | Oplosmiddel B (%) | Tyd (CV) | Oplosmiddel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultate en bespreking
'N SEPAFLASH C18AQ RP -flitspatroon is gebruik vir die ontheiliging en suiwering van die monster. Stapgradiënt is gebruik waarin suiwer water aan die begin van die eluering as die mobiele fase gebruik is en vir 10 kolomvolumes (CV) gebruik word. Soos getoon in Figuur 3, is die monster heeltemal op die flitspatroon behoue gebly by die gebruik van suiwer water as die mobiele fase. Vervolgens is die metanol in die mobiele fase direk tot 100% verhoog en die gradiënt is vir 7,5 CV gehandhaaf. Die monster is van 11,5 tot 13,5 CV geëlueer. In die versamelde breuke is die monsteroplossing vervang deur NaH2PO4 -bufferoplossing tot metanol. In vergelyking met 'n hoogs waterige oplossing, was metanol baie makliker om in die daaropvolgende stap deur roterende verdamping verwyder te word, wat die volgende navorsing vergemaklik.
Figuur 3. Die flitschromatogram van die monster op 'n C18AQ -patroon.
Om die retensiegedrag van die C18AQ -patroon en die gewone C18 -patroon te vergelyk vir monsters van sterk polariteit, is parallelle vergelykingstoets uitgevoer. 'N SEPAFLASH C18 RP -flitspatroon is gebruik en die flitschromatogram vir die monster is in Figuur 4 getoon. Vir gewone C18 -cartridges is die hoogste verdraaide waterfase -verhouding ongeveer 90%. Daarom is die begingradiënt op 10% metanol in 90% water gestel. Soos getoon in Figuur 4, is die monster skaars op die gewone C18 -patroon, as gevolg van die hidrofobiese fase -ineenstorting van die C18 -kettings wat veroorsaak word deur 'n hoë waterige verhouding, en is direk deur die mobiele fase geëlueer. As gevolg hiervan kan die werking van monsterbesparing of suiwering nie voltooi word nie.
Figuur 4. Die flitschromatogram van die monster op 'n gewone C18 -patroon.
In vergelyking met die lineêre gradiënt, het die gebruik van stapgradiënt die volgende voordele:
1. Die gebruik van oplosmiddel en looptyd vir monsteruiwering word verminder.
2. Die teikenproduk lig in 'n skerp piek, wat die volume versamelde breuke verminder en sodoende die volgende verdamping van roterende en besparing vergemaklik.
3. Die versamelde produk is in metanol wat maklik is om te verdamp, en die droogtyd word dus verminder.
Ten slotte, vir die suiwering van die monster wat sterk polêr of hoogs hidrofilies is, kan sepaflash C18AQ RP -flitspatrone gekombineer word met die voorbereidende flitschromatografiestelsel Sepabean ™ -masjien 'n vinnige en doeltreffende oplossing.
Oor die Sepaflash -gebonde reeks C18 RP -flitspatrone
Daar is 'n reeks van die Sepaflash C18AQ RP -flitspatrone met verskillende spesifikasies van Santai -tegnologie (soos aangetoon in Tabel 2).
| Itemnommer | Kolomgrootte | Vloeitempo (ML/min) | Max.pressure (PSI/balk) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabel 2. Sepaflash C18AQ RP -flitspatrone.
Verpakkingmateriaal: Sferiese C18 (AQ) -gebonde silika, 20-45 μm, 100 Å.
logy (soos aangetoon in Tabel 2).
Postyd: Aug-27-2018